实时荧光定量PCR扩增效率低怎么办
根据模板的来源不同选择不同的标准品，且浓度已知。标准品可以自己制备也可以购买。
然后在进行定量的时候对标准品进行浓度梯度稀释（5倍/8倍/10倍），由于CT值跟浓度的负对数存在线性关系，所以根据CT值和已知的浓度画出标曲。一般情况下机器会自动给出标曲。
PCR原理中，反应一个循环，PCR产物扩增一倍，即为之前的2倍。……反应N个循环，理论上应为原来的2的N次方。此时，理论的扩增效率是100%，即1。
但实际上，由于酶，dNTPs，引物，模板等因素，扩增效率达不到100%。
因此，我们就要做标准曲线，看实际的扩增效率是多少，也就是标准曲线的斜率。理论上100%的扩增效率，换算出来的斜率是-3.32。
为了最高效地设计用于实时荧光定量PCR的引物和探针，我们强烈建议您使用引物设计软件。大多数引物设计程序均包含了可调节的参数以设计最佳的引物和探针。这些参数涉及了引物/探针的Tm值、互补性、二级结构以及扩增子大小等重要因素。另外还建议您限制连续的重复核酸数目。当设计用于真核目标序列的扩增子时，请选择在目标mRNA中至少跨越一个外显子-外显子接合点的PCR引物对，以避免从残留的基因组DNA模板扩增目标片段。
使用了低质量的RNA
已降解的或低纯度的RNA会抑制反转录效率并降低得率。所用的RNA应当来自于新鲜组织，或者经过RNA稳定试剂处理过的组织，如RNAlater®短片段试剂（70–250 bp）等。这样可以避免少部分降解RNA对结果的影响。若无法使用完全完整的RNA，则可以使设计的引物对与感兴趣基因内部区域进行匹配。需要注意的是，对于真正的实时荧光定量PCR，部分降解的RNA可能无法给出基因表达的精确结果。
未使用“预混液”
qRT-PCR是一种分析RNA的高灵敏工具。由于PCR反应会扩增目的基因，所以误差也会被同时扩增出来。因此，无论何时都应当确保变异处于最低水平。“预混液”是反应试剂的混合液，在设置建立多个反应时应当使用它来最小化样品间和反应孔间的差异以提高可重复性。为了进一步减少孔间差异，可以向预混液中加入ROX等参比荧光。
引入交叉污染
对PCR区域的所有表面均应当使用DNA去污染试剂来进行日常去污染工作以防止交叉污染，推荐使用如DNAzap™的试剂，其可以破坏DNA。可以使用“无模板对照“（NTC）来排除试剂和实验桌面的交叉污染。NTC含有除RNA模板外的所有RT-PCR试剂。通常是用无核酸酶水简单地替换掉反应中的RNA。反应后NTC中应当没有合成任何产物；若有产物被合成了，则意味着RT-PCR试剂中的一种或多种被扩增产物污染了。
未使用“– RT”对照
在RNA制备过程中，事实上不可能完全去除基因组DNA。因此，在qRT-PCR实验中有必要加入无逆转录酶对照（“非扩增对照“，还可记为NAC）。通常，NAC是一个模拟的逆转录反应，其中含有除逆转录酶之外的所有RT-PCR试剂。若在NAC中可观察到产物，通常意味着样品中残留有DNA。
使用了不适当的均一化对照
任意qRT-PCR实验的可靠性均可以通过在实验中引入一个不变的内参对照得到改善，这样做有助于改善qRT-PCR的样品间差异以及样品定量过程中的误差。一个好的对照，其表达水平应当在所分析的样品中保持不变。通常我们使用18S rRNA作为对照，因为它相比其他传统内参对照如ß-actin或GAPDH等表达水平变化更小。
使用SYBR® Green时未进行熔解曲线分析
理想情况下，实验样品在扩增子熔解温度下会产生一个清晰的峰（一阶导数图），而NAC及NTC则不会产生任何明显的荧光信号。这类结果意味着PCR产物是特异性的，且此时SYBR Green I 荧光是对目的产物的累积的直接测量。若熔解曲线显示为一系列的峰，则意味着此时很难分辨出特异性及非特异性反应产物。为了获取有意义的数据，这种情况下必须对qRT-PCR进行优化。
没有正确地设置基线和阈值线
为了得到精确的Ct值，应当在丰度最高的样品所对应Ct值两个循环之前设置基线。为了使实时荧光定量PCR的数据有意义，应当在指数扩增期设置阈值线。典型情况下，阈值应当设置在基线至少10个标准差范围内。
扩增效率低
扩增效率(Eff)可以通过以下公式进行计算：
Eff = 10 (–1/slope) – 1
PCR的效率应当在90-110%之间（3.6 > 斜率 > 3.1）。有一系列变量会影响到PCR的效率。举例来说，这些因素包括扩增子的长度、二级结构以及引物设计等。尽管扩增效率落在上述范围之外时，我们也可以得到有效数据，但是仍然应当对qRT-PCR进行进一步优化或改变扩增子设计。
使用不正确的范围来制作标准曲线
在RNA定量研究（绝对或相对定量）中或验证PCR（delta-delta-Ct）的扩增效率时，对于每个基因都应当制备标准曲线。标准曲线数据点应当覆盖您的目标基因期望丰度。额外的数据点也可以包括在内，例如在极限上下方的最小及最大RNA量等，以帮助区分特异性和非特异性产物。
荧光定量pcr原理
荧光定量PCR原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制...
什么是实时荧光定量pcr
实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的...
科普讲堂|实时荧光定量PCR检测方法
探针法中最常用的TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，PCR扩增时在加入引物的同时加入探针，探针完整时，荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而检测器可以接收到荧光信号。3. ...
实时荧光定量PCR扩增效率低怎么办
PCR的效率应当在90-110%之间（3.6 > 斜率 > 3.1）。有一系列变量会影响到PCR的效率。举例来说，这些因素包括扩增子的长度、二级结构以及引物设计等。尽管扩增效率落在上述范围之外时，我们也可以得到有效数据，但是仍然应当对qRT-PCR进行进一步优化或改变扩增子设计。使用不正确的范围来制作标准曲线 在...
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理如下：荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以探针法荧光定量PCR为例：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个...
什么是实时荧光定量PCR,检测指标是什么?
实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。检测指标是...
概述荧光定量PCR技术的原理。
这就是荧光定量PCR的原理。在PCR的过程中，连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化，当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值，即阈值)，此时循环次数(ct)就被记录下来，该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，利用...
荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思
PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1.但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%.因此,我们就要做标准曲线,看实际的扩增效率是多少,也就是标准曲线的斜率.理论上100%的扩增效率,换算出来的斜率是-3.32.
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理是：在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意...
实时荧光定量PCR的结果该怎样分析?
1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；2、一般都是相对量，则用deltadeltaCT方法来计算；3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们...
招文西点： 引物和探针设计不当 为了最高效地设计用于实时荧光定量PCR的引物和探针,我们强烈建议您使用引物设计软件.大多数引物设计程序均包含了可调节的参数以设计最佳的引物和探针.这些参数涉及了引物/探针的Tm值、互补性、二级结构以及...
省直辖行政单位13435176958： 关于定量pcr的效率值问题 - ？
招文西点： 首先你要确定你做的是什么定量,是相对定量还是绝对定量,相对定量有两种方法,一种是标准曲线法,一种是ΔΔCt法,你师兄可能做的第二种方法,是不需要做标曲的,而你做的是第一种方法标准曲线法,做一要经过浓度梯度稀释来定量....
省直辖行政单位13435176958： 荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么办 - ？
招文西点： 1、调整下体系,不要自己配置反应液,最好用商品的MIX,这样各个组分都是最佳的配比. 2、三步法改为两步法,退火延伸设置为一步,大部分的温度为60度,这个只是建议,具体看你买的试剂的说明书,会有具体的说明. 3、很有可能有非特异性扩增,自己排查下反应体系,根据溶解曲线是否单峰,扩增曲线CT值综合分析.
省直辖行政单位13435176958： 实时荧光定量pcr阴性对照有扩增怎么解决 - ？
招文西点： 说明扩增失败.常见原因如下:(1)定量试剂质量较差;(2)模板质量太差;(3)引物质量太差;(4)PCR扩增时反应程序的设置有问题.
省直辖行政单位13435176958： 实时荧光定量PCR的结果该怎样分析? - ？
招文西点： 1、如果有标准曲线,按照标准曲线计算; 2、一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计算; 3、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性; 4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起; 5、看CT值是分析...
省直辖行政单位13435176958： 为什么实时荧光定量pcr做不出来,普通pcr可以 - ？
招文西点： 为什么实时荧光定量pcr做不出来,普通pcr可以 普通的PCR大多数是定性实验,而实时荧光定量PCR则定量和定性都可以做.应用领域也不一样,普通PCR一般应用于基因组克隆、DNA测序、RNA反转录等,而实时荧光定量PCR一般应用于mRNA表达量分析、绝对定量、蛋白表达、SNP分析、阴阳性解析等领域.不是定量PCR比PCR好,而是两者应用与不同的领域,起到了不同的作用. 荧光定量PCR较普通PCR不同的一点就是可以实时检测PCR扩增产物,从而可进行绝对定量或者相对定量.
省直辖行政单位13435176958： 实时荧光定量PCR结果无法分析,求助 - ？
招文西点： 实时荧光定量PCR结果无法分析 所谓实时荧光定量PCR技术 ,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法. 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法: 在PCR反应体...
省直辖行政单位13435176958： 荧光定量PCR(探针法)实验出现问题,通常需要进行哪些数据核查,从而判断可能的原因? - ？
招文西点： 1,检查引物探针的特异性等 2.检查所用模板质量数据核查的话主要看你所测得的数据是否跟你的理想状态差距很大,或数据是否符合常理. 再就是看数据得看下相关系数和扩增效率 ....
省直辖行政单位13435176958： 以下哪些因素会导致pcr扩增产物污染 - ？
招文西点： 引物和探针设计不当 为了最高效地设计用于实时荧光定量PCR的引物和探针,我们强烈建议您使用引物设计软件.大多数引物设计程序均包含了可调节的参数以设计最佳的引物和探针.这些参数涉及了引物/探针的Tm值、互补性、二级结构以及...
省直辖行政单位13435176958： 我做荧光定量PCR标准曲线时,斜率只有 - 1.25,扩增效率E很高.为什么呢? - ？
招文西点： 扩增效率理论上不可能超过2.计算值超过2,可能是因为PCR效率不高或者不稳定,结果线性度差,导致某个区间的数据点计算出来的扩增效率反而大于2.这样的标准曲线如果作图的话,数据点都不在一条直线上.一般都是试剂扩增效率有问题...
