概述荧光定量PCR技术的原理。
又称实时PCR技术。该技术在常规PCR基础上，添加了一条标有两个荧光基团的荧光双标记探针，一个标记在探针的5′端称为报告基团(Reporter，R)；另一个标记在探针的3′端称为荧光抑制基团或称淬灭基团(Quencher，Q)。两者可构成能量传递结构，即5′端R发出的荧光信号可被3′端R基团抑制。3′端的-OH已被封闭，不具有延伸的能力。探针引物在无特异性PCR扩增时，荧光信号不改变。在PCR反应开始后，随着链的延长，荧光定量PCR的Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合部位，发挥它的5′-3′外切酶活性，将荧光探针切断。一但切断，Q基团的抑制作用消失，从而引起R基团的荧光信号增长，被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系，因此R基团的荧光信号的强弱就与PCR产物的数量成正比关系。测定出前者就可以推算出后者。这就是荧光定量PCR的原理。在PCR的过程中，连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化，当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值，即阈值)，此时循环次数(ct)就被记录下来，该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，利用阳性梯度标准品的ct值，制成标准曲线，再根据样品的ct值就可以准确定出起始DNA的拷贝数。
什么是实时荧光定量PCR,检测指标是什么?
实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。检测指标是...
实验技巧 | 实时荧光定量PCR实验数据分析(超全教程)
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种精确测定DNA扩增过程中目标序列含量的实验技术，其数据处理与理解是关键。这个技术利用荧光标记的PCR产物在每次循环后的积累来实时监测，从而得出Ct值，进而推断模板基因的浓度。基本原理上，PCR反应过程被划分为四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。Ct值，即...
荧光定量PCR技术有什么特点?
影响荧光PCR的因素很多，但从操作和技术上来讲应该要注意一下几点：1.RNA的完整性 因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量，所得的结果也是错误的。所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范，避免RNA酶的污染。2.RNA样品中的基因组DNA污染 提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组...
荧光定量PCR的操作步骤
荧光定量PCR 实验步骤： ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA...
荧光定量PCR(qPCR)——引物设计篇
荧光定量PCR（qPCR）的引物设计至关重要，它直接关系到实验的准确性和效率。设计时需考虑的关键因素包括特异性、扩增效率和产物长度。以下是几个关键步骤：首先，引物设计需跨越内含子，确保扩增产物只来自cDNA，消除gDNA污染可能带来的干扰。其次，引物长度应控制在18-30nt，产物长度保持在100-300bp，避免...
什么是实时荧光定量PCR?有什么作用?请详细说明。
实时荧光定量PCR即 Real time PCR(也称实时定量PCR)定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自...
荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思
PCR原理中,反应一个循环,PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1.但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%.因此,我们就要做标准曲线,看实际的扩增效率是多少,也就是标准曲线的斜率.理论上100%的扩增效率,...
荧光定量 PCR 方法:探针法 VS 染料法?
荧光定量 PCR 又称 qPCR，是一项非常常见的分子生物学实验技术。荧光定量 PCR 荧光为基础对核酸进行定量分析，其应用非常广泛，可以用于检测基因的表达量（RNA 的丰度），验证表达谱芯片或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对片段的拷贝数（CNV）进行分析，对基因进行分型等等。大部分研究者主要的...
实时荧光定量pcr仪的技术原理
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了...
荧光定量pcr属于分子光谱吗
荧光定量pcr不属于分子光谱。分子光谱法是由分子中电子能级，振动和转动能级的变化产生的，表现为带光谱。属于这类分析方法的有，紫外可见分光光度法(UV-Vis)，红外光谱法（IR)分子荧光光谱法（MFS)和分子磷光光谱法(MPS)，核磁共振与顺磁共振波谱（N）等。荧光定量PCR技术是为了测定样本中特异的PCR片段...
定庆阿美：[答案] 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 .在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 .无论定性还是定量分析,分析的...
西吉县19843325842： 荧光定量PCR对初始模板量进行定量分析的原理是什么? - ？
定庆阿美：[答案] 基于以下的理论. 1.每一个循环都会扩增一倍 2.引物扩增的效率一致 所以,如果结果X循环,产物得到了2的X次方.如果起始模板只有一半量,那产物就是2的(x-1)次方.如果起始模板的量是一倍,那产物就是2的(x+1)次方,以此类推. 只要在产物...
西吉县19843325842： 荧光定量PCR的 简单解释 - ？
定庆阿美： 荧光定量PCR是( realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度.
西吉县19843325842： PCR技术原理是什么 - ？
定庆阿美： PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩...
西吉县19843325842： 实时定量PCR基本原理如何? - ？
定庆阿美： 实时PCR(real—time polymerase chain reaction)又称荧光定量PCR或TaqMan PCR,是美国PE公司(Perkin Elmer)于1995年研制出的一种新的核酸定量技术.该技术在常规PCR基础上运用荧光能量传递(fluorescence resonance energy ...
西吉县19843325842： 实施荧光定量PCR的原理及使用方法？
定庆阿美： 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料. 原理: PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.
西吉县19843325842： 求荧光定量PCR分析基因多态性原理及举例,谢谢! - ？
定庆阿美： 原理:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.举例:临床疾病诊断:各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价;地中海贫血、...
西吉县19843325842： 定量PCR简介,简略易懂. - ？
定庆阿美： 定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技术有广义概念和狭义概念.广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量.狭义概念的定量PCR技术(严格意义的定量PCR技术)是指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程(监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的,同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零).
西吉县19843325842： 荧光定量PCR中分子信标技术的原理?fgege - ？
定庆阿美：[答案] 分子信标是一段呈茎环结构的寡核苷酸探针,中间的环序列与目标核酸序列互补,茎的两端分别连的荧光分子和猝灭分子,如下图: 当无目标核酸序列时,荧光分子和猝灭分子距离近,荧光分子发出的能量被猝灭分子吸收并以热能消耗,不发荧光;...
