提取RNA的血液怎样保存

提取RNA的血清如何冻存~

、组织样品采集
1. 首先准备好用于包装样品的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样品编号。
2. 准确切除所需组织。
3. 离体新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。
4. 在RNase-free 的0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。
5. 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。
6. 把样品袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织，样品较多时应分装至多个小袋，不要在一只样品袋中放过多的样品以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘2 张标签纸（标签上注明：客户名、样品名称、编号、日期，粘2 张标签纸是为了防止标签脱落造成样品混乱），迅速转入液氮罐。
7. 填写样品登记单，写明样品名称、组织类型、编号、取样日期、样品处理过程等情况。
注意事项
1. 对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。
2. 不要用 Eppendorf 管保存组织样品，因为 Eppendorf 管从液氮中取出时极易发生爆裂而造成样品损失。
3. 步骤 2～5应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品RNA降解 。
4. 在临床手术过程中采集的病理或正常样品，如果没有条件立即从手术室中取出进行后续处理，请在切除后立即转移到液氮中保存。
二、细胞及血液样品采集
贴壁细胞
1. 贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液；
2. 按每10 cm2 培养面积加1 mL TRIzol 试剂的比例加入TRIzol 试剂；
3. 用1 mL枪头反复吹打, 使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化；
4. 转移到RNase-free 的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应该为清亮而且不粘稠的状态；
5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。
悬浮细胞
6. 悬浮细胞培养或处理结束后，去除培养液；
7. 保留的细胞用PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液；
8. 按照每5×106 个细胞加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；
9. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。
血液
1. 在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀；
2. 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000 g 离心30 min；
3. 用移液枪小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清；
4. 加入白细胞20倍体积的TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；
5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。
三、总RNA 样品制备操作流程
1. 用于RNA 提取的试剂及其他物品必须为RNase-free 的，并且尽量在洁净、不通风的环境中进行实验。
2.应当选用自己熟悉的或公认可以得到良好实验结果的提取方法（如使用EasyExtract、TRIzol或RNeasy ）进行RNA 的提取。
3. 可以根据实际需要选择RNA 的保存方法：需要长期保存的RNA 样品保存于75％乙醇中；无需长期保存的RNA 样品保存于RNase-free 的双蒸水或Elution buffer 中，样品浓度不应低于3μg/μl (需要扩增的样品浓度不应低于0.2μg/μl)。
4. RNA质量，即A260/A280比值应在2左右，总RNA电泳检查需要有清晰的18s和28s rRNA条带，同时28s/18s的比例应在2：1以上，70°C 水浴保温1 小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
四、其他的样品处理方法
RNAlater
1．简介
RNAlater 是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA 于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater 中保存，而不会引起RNA 的降解，这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理。RNAlater 应保存在室温下，保质期6 个月。如放置在4℃条件下则会引起沉淀，此时需加热到37℃才可澄清。RNAlater 可广泛应用于多种脊椎动物样品。包括脑、心、肾、脾、肝、睾丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater 对大肠杆菌、果蝇、组织培养细胞、全血细胞和一些植物也有效。RNAlater 可与大多数RNA 提取方法相协调。特别是TRI Reagent., RNAwiz, TōTALLY RNA,RNAqueous, and Poly(A)Pure。
2. 如何使用RNAlater
RNAlater 只能用于新鲜组织，在浸入RNAlater 之前不能冷冻组织。简单切碎组织样品，任何一边的最大厚度不能大于0.5cm, 然后将组织碎块放入到5 倍体积的RNAlater 中保存。
动物组织
RNAlater 不会溶解或破坏组织样品的结构。如果需要的话，仍可将已经平衡在RNAlater 溶液中的组织取出并分割成更小的块再重新放入到RNAlater 中。小器官如鼠肝、肾和脾可以完整地保存在RNAlater 中。
植物组织
许多植物组织可以简单浸泡在5 倍体积的RNAlater 中保存。具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater 进入组织。
组织培养细胞
沉淀细胞，用PBS 洗一次，再用少量的PBS 悬浮细胞，然后加5~10 倍体积的RNAlater 保存。
白细胞
如果将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNAlater 中。不要将全血、血浆或血清中的RNA 保存在RNAlater 中，因为它们蛋白含量过高，与RNAlater 混合后易形成不溶的沉淀。
细菌
RNAlater 是抑菌的，虽然细菌在RNAlater 中不能生长，但细胞仍保持其完整性。大肠杆菌保存在RNAlater 中4℃条件下1 个月仍很完整，产生不降解的RNA。
3. RNAlater 中样品的保存
保存于-80℃
建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后从RNAlater 溶液中取出样品保存于-80℃。对于组织培养细胞，不必移去RNAlater，只需简单冻存整个溶液。实验证明，细胞在-80℃条件下冻存于 RNAlater 溶液中并未出现溶解。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。
保存于-20℃
建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后转移到-20℃。样品在-20℃条件下不会冻结，但在存贮缓冲液中会有结晶形成，这并不影响随后的RNA 提取。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA 的质和量都不会受到影响。
保存于4℃
目前尚无证据证明样品存于4℃ 1 个月内会出现RNA 降解。
如果没有冰箱：
将样品放在尽可能冷的环境中。如果周围温度超过25℃，应尽可能使RNAlater 中的样品冰浴数小时。
4. RNAlater 中样品的RNA 提取
组织
用消毒镊子将组织从存贮溶液RNAlater 中取出，浸泡在RNA 提取溶液中。一旦将组织放入RNA提取溶液中，匀浆一定要迅速进行。
细胞
从存贮在RNAlater 中的细胞中提取RNA 有两种操作方法可供选择：去除RNAlater 或者从细胞与RNAlater 的混合物中直接提取RNA。
5. 从RNAlater 中取出样品
去除RNAlater
因为RNAlater 的浓度比典型的细胞培养介质的浓度高，因此用通常沉淀活细胞的离心力无法沉淀RNAlater 中的细胞。离心沉淀细胞，去除RNAlater。（HeLa 细胞大约需要3000×g，但其他细胞可能不能容忍这个速度，或者他们需要更大的离心力。）
从RNAlater 中的细胞直接提取RNA
作为选择，我们可以用一步法破碎/提取溶液（如TRI Reagent 和RNAwiz）从没有去除RNAlater 的细胞中纯化RNA。这可通过向细胞混合物中加入10 倍体积的一步提取溶液完成，其他照常。

RNAsecure：
1.简介
在分子生物学试剂中用的RNAsecure 代替DEPC，有很多优点：
1) 可以加入到不能用DEPC 处理的溶液中（如：Tris 或MOPS 缓冲液）；
2) 可以加入到不能被高压灭菌的溶液中；
3) 可以加入到加酶之前的酶促反应中。有RNAsecure 试剂存在的如下酶促反应（先于酶加入）：RNA 多聚酶T7，T3 和SP6 的体外转录（37℃），MMLV 和AMV逆转录（42℃），以及SuperTaq PCR（94℃），均没有出现酶抑制现象。
2. 使用方法
1) 用缓冲液或经过处理的溶液稀释RNAsecure 试剂到1×，充分混匀。
2) 将混合物在60℃水浴温浴20 min，冷却至室温。这样的溶液可备用于接下来的RNA 提取和分析，或者保存于室温、4℃或-20℃以备将来使用。
3) 为了消除任何可能发生在经过初处理之后的RNA 酶的污染，在使用前可以将RNAsecure 溶液在60℃水浴中重新温浴10~20 分钟。
3. 注意事项
RNAsecure 试剂只在高于45℃的条件下才有活性，但当反应体系孵育温度超过该温度时可能会使一些酶失活。因此，用RNAsecure 处理反应缓冲液时要以加入酶之前做为临界点，然后进行酶促反应时孵育温度低于45℃。注意：这不适用于Taq 多聚酶。
五、样品制备常用仪器和试剂及耗材
1. 常用试剂及耗材
DEPC
TRIzol Reagent
氯仿：异戊醇
一次性注射器及针头
Qiagen RNeasy Mini kit
Qiagen RNAlater
Ambion RNAsecure Reagent
Tip（RNase-free）
微量离心管（RNase-free）
2.样品制备过程中使用物品的RNase-free处理
RNase-free 水：0.1%DEPC 处理（用磁力搅拌器搅拌过夜），高压灭菌。
氯仿
无水乙醇(新包装开封后注明RNA专用)
75%乙醇：用RNase-free 的水配制。
离心管和冷冻保存管以及Tip头浸泡在0.1%DEPC 水中过夜，干燥后高压灭菌。
其他玻璃或金属器具用铝箔纸包裹后180℃干烤过夜。
任何接触样品的操作需佩戴一次性手套,避免直接接触样品。

这里有个文献，不要抗凝
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/5/8/1961.full

在用血液标本进行基因表达研究时，需要及时把新鲜血液中有核细胞的RNA提取出来。全血还不能直接放到-80℃保存，即使在-80℃保存，全血中的RNA也容易发生降解。传统的提取新鲜全血RNA方法是把先把有核细胞从全血中分离出来，需要加白细胞分离液、离心等步骤，比较繁琐，在临床医院往往难以实施。作为RNA提取的领先公司，北京艾德莱的研发人员在05年国内首家研发成功液体样本RNA提取试剂RN01 TRIpure LS(LS 意思是Liquid Sample。可以直接裂解全血提取RNA，避免了先裂解白细胞可能导致的RNA降解，也大大简化了操作步骤。操作时间比普通方法节约至少三分之一。

在临床上采血时，可以先把TRI pure LS Reagent分装750ul到1.5ml的离心管中。血液样本可以先抗凝处理（EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可），然后取250ul全血样品加入到750ul的TRI pure LS Reagent中，用移液枪反复抽打并振荡混匀，在室温裂解5min-10min，直至血细胞充分发生裂解。然后可把此裂解液保存在-20℃下可达2个月，-80℃可达半年。在此期间，可以把该裂解液运输到北京艾德莱生物公司进行RNA的抽提，运输过程可以4℃ 1天，-20℃ 一周。

在全血RNA提取试剂直接裂解全血的基础上面，北京艾德莱又进一步简化了操作，增加了离心柱操作，推出了RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒。点此详见。经过离心柱子吸附漂洗，除了进一步简化了操作步骤外，更适合临床高通量操作外， 还极大的提高了RNA的纯度。除了一般常见的RT PCR 或者荧光定量PCR外，RNA纯度可以满足最严格的实验要求比如基因表达谱芯片要求， 1ml的全血可以得到10μg左右的total RNA，足够满足芯片分析的需要

最重要的是加RNase inhibitor。这个是为了防止RNA被自然降解掉。
当然冷冻可以降低RNase的活性，所以刻意配合这种方式。

冷冻

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任县17050794947： 提取RNA的血液怎样保存 - ？
兆宗奥德：[答案] 最重要的是加RNase inhibitor.这个是为了防止RNA被自然降解掉. 当然冷冻可以降低RNase的活性,所以刻意配合这种方式.

任县17050794947： 提取RNA的血清如何冻存 - ？
兆宗奥德：[答案] 、组织样品采集 1. 首先准备好用于包装样品的铝箔或冷冻保存管,并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样品编号. 2. 准确切除所需组织. 3. 离体新鲜组织,立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型. 4. 在RNase-free 的0.9%生...

任县17050794947： 我想提取奶牛全血中的单核细胞mRNA,由于采集血液的地方离实验室较远,为了使mRNA不降解,怎么保存血呢? - ？
兆宗奥德： 您好,细胞不被破坏的话RNA并不容易发生降解,请您放心.根据以前去手术室取血的经验,使用紫头管(柠檬酸钠抗凝管)取血,保存在冰盒里运送到实验室需1-2小时,RNA能被正常提取,离心时注意4°C离心就好.另外,关于从血液中的...

任县17050794947： 我提鸽子血液中RNA,但不能马上做实验,我得如何保存鸽子血液呢?是先加抗凝剂再放冰箱中还是直接放冰箱中？
兆宗奥德： 你好,很高兴能为你解答提问. 最好用新鲜血液提取,不具备条件时先抗凝再冷冻保存. 抗凝剂最好用肝素,因为EDTA可能会对后续的PCR有影响,会螯合PCR反应中的Mg2+,亦可根据实验要求选择适当的抗凝剂. 冷冻血液的保存:先液氮速冻,再置于- 80℃保存. 用TRIZOL试剂盒防止RNA降解. 希望能帮到你.

任县17050794947： 化验HCV RNA的血液如何保存 - ？
兆宗奥德： 如果是零时性保存的话,可以放在冰箱的冷藏室里,可以保存几个小时,如果是实验室的标本存储的话,最好是放在超低温冰箱内保存,温度-40~80°,标本可以保存十几年.

任县17050794947： 跪谢先,我要收集骨髓液,分离单核细胞提取DNA和RNA.应该怎样保存骨髓液呢 - ？
兆宗奥德： 一般生物样品都是放在-80冰箱保存,不过如果是蛋白的话,-80冰箱保存两个月也会降解!RNA时间久更短了.融化时,打一盒冰 ,样品放在冰上溶解.运输条件一般有两种,一种是放冰袋到泡沫盒中,另一种就是放干冰到泡沫盒中,

任县17050794947： 用于提取RNA新鲜组织如何保存 - ？
兆宗奥德： 市场上有一种非冰型RNA样品保存液.有些公司叫RNAwait,或者还有别的名称,你可以了解一下. 很多公司都有的. 非冻型组织细胞RNA保存液(RNAwait)是一种在较高温度下保存动物组织及细胞RNA样品的非冻型无毒溶液,它能迅速渗入细胞...

任县17050794947： trizol法提取血中的RNA,怎样做量会更多 - ？
兆宗奥德： 或再适当延长一点时间.迅速离心,少加些血.混匀之后放置10分钟左右,混匀再去离心. 可以不用先离心去沉淀之后再加三氯甲烷1 血要新鲜,之后加75%乙醇.只洗一遍. 3 每个步骤操作要快,用的时间药短些,防止降解 4 异丙醇沉淀的时候,放-20°C的冰箱半个小时.一般我都加的30.如果需要浓度高点可以少加水. 6 提取RNA之后迅速反转录成cDNA再保存,洗2遍易损失部分RNA.如果是冻存的,在解冻时要完全,之后再加Trizol. 2 可以稍多加一些Trizol,直接加三氯甲烷.干燥一会就迅速加DEPC水少量. 5 不要过分干燥,管内稍有点残余的乙醇也没关系

任县17050794947： RT - PCR:每天只能提取几份血样本的total RNA,请问我是应该提取完之后直接 - 80保存还是先反转录再保存? - ？
兆宗奥德： 看做什么用,如果以后还用到RNA的话就先保存.但是如果你要接着马上做下一步实验的话,就先反转录成cDNA比较稳定,不易降解.

任县17050794947： 关于全血DNA提取的问题探讨? - ？
兆宗奥德： 可以直接保存的,之前提取大鼠血液有用过BIODAI血液RNA保存液,就可以直接保存,有的人放置了半年甚至一年才提取,也是能提取出来的,但是提取的量上肯定是没有新鲜的血液多,最好在提取的1到2个月内提取,这样对实验结果不会造成太大的影响.