提取RNA的血清如何冻存

血清RNA提取实验前，血清如何保存？~

这里有个文献，不要抗凝
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/5/8/1961.full

按照Invitrogen公司的Tizro说明书，在提取RNA过程中进行到加入75%乙醇后，可使RNA沉淀在4度保存一个月，在-20度保存一年。
1、以沉淀的形式保存在无水乙醇中；
2、以溶液的形式冻存在-80冰箱，并且尽量少冻融；
3、按试剂商提供的说法，保存在裂解液中可达2年；
一般这种方法用的比较少，因为每次提RNA都是一气下来，中间没有停顿的，除非一次提很多，上午时间不够用，可进行到加入乙醇未知，然后放到-20度冰箱，下午可继续进行。

背景
反复冷冻-解冻引起冰晶的多次重新形成，损坏了肌细胞的结构、失去肌纤维的完整性，加速了脂肪氧化。
冷冻畜肉在现代肉及肉制品加工工业中起着重要的作用, 是国家储备和调节肉食品市场的重要筹码, 也是肉类产品在进出口贸易和国内地区间流通的主要产品形态。相对与新鲜肉, 冷冻肉的低温条件能抑制大多数微生物生长繁殖、降低酶活性、延长货架期、增加肉制品消费的机动性和可支配性[ 2-3] , 但冷冻过程中会产生大小不一的冰晶。

、组织样品采集
1. 首先准备好用于包装样品的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样品编号。
2. 准确切除所需组织。
3. 离体新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。
4. 在RNase-free 的0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。
5. 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。
6. 把样品袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织，样品较多时应分装至多个小袋，不要在一只样品袋中放过多的样品以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘2 张标签纸（标签上注明：客户名、样品名称、编号、日期，粘2 张标签纸是为了防止标签脱落造成样品混乱），迅速转入液氮罐。
7. 填写样品登记单，写明样品名称、组织类型、编号、取样日期、样品处理过程等情况。
注意事项
1. 对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。
2. 不要用 Eppendorf 管保存组织样品，因为 Eppendorf 管从液氮中取出时极易发生爆裂而造成样品损失。
3. 步骤 2～5应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品RNA降解 。
4. 在临床手术过程中采集的病理或正常样品，如果没有条件立即从手术室中取出进行后续处理，请在切除后立即转移到液氮中保存。
二、细胞及血液样品采集
贴壁细胞
1. 贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液；
2. 按每10 cm2 培养面积加1 mL TRIzol 试剂的比例加入TRIzol 试剂；
3. 用1 mL枪头反复吹打, 使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化；
4. 转移到RNase-free 的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应该为清亮而且不粘稠的状态；
5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。
悬浮细胞
6. 悬浮细胞培养或处理结束后，去除培养液；
7. 保留的细胞用PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液；
8. 按照每5×106 个细胞加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；
9. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。
血液
1. 在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀；
2. 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000 g 离心30 min；
3. 用移液枪小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清；
4. 加入白细胞20倍体积的TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；
5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。
三、总RNA 样品制备操作流程
1. 用于RNA 提取的试剂及其他物品必须为RNase-free 的，并且尽量在洁净、不通风的环境中进行实验。
2.应当选用自己熟悉的或公认可以得到良好实验结果的提取方法（如使用EasyExtract、TRIzol或RNeasy ）进行RNA 的提取。
3. 可以根据实际需要选择RNA 的保存方法：需要长期保存的RNA 样品保存于75％乙醇中；无需长期保存的RNA 样品保存于RNase-free 的双蒸水或Elution buffer 中，样品浓度不应低于3μg/μl (需要扩增的样品浓度不应低于0.2μg/μl)。
4. RNA质量，即A260/A280比值应在2左右，总RNA电泳检查需要有清晰的18s和28s rRNA条带，同时28s/18s的比例应在2：1以上，70°C 水浴保温1 小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
四、其他的样品处理方法
RNAlater
1．简介
RNAlater 是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA 于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater 中保存，而不会引起RNA 的降解，这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理。RNAlater 应保存在室温下，保质期6 个月。如放置在4℃条件下则会引起沉淀，此时需加热到37℃才可澄清。RNAlater 可广泛应用于多种脊椎动物样品。包括脑、心、肾、脾、肝、睾丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater 对大肠杆菌、果蝇、组织培养细胞、全血细胞和一些植物也有效。RNAlater 可与大多数RNA 提取方法相协调。特别是TRI Reagent., RNAwiz, TōTALLY RNA,RNAqueous, and Poly(A)Pure。
2. 如何使用RNAlater
RNAlater 只能用于新鲜组织，在浸入RNAlater 之前不能冷冻组织。简单切碎组织样品，任何一边的最大厚度不能大于0.5cm, 然后将组织碎块放入到5 倍体积的RNAlater 中保存。
动物组织
RNAlater 不会溶解或破坏组织样品的结构。如果需要的话，仍可将已经平衡在RNAlater 溶液中的组织取出并分割成更小的块再重新放入到RNAlater 中。小器官如鼠肝、肾和脾可以完整地保存在RNAlater 中。
植物组织
许多植物组织可以简单浸泡在5 倍体积的RNAlater 中保存。具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater 进入组织。
组织培养细胞
沉淀细胞，用PBS 洗一次，再用少量的PBS 悬浮细胞，然后加5~10 倍体积的RNAlater 保存。
白细胞
如果将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNAlater 中。不要将全血、血浆或血清中的RNA 保存在RNAlater 中，因为它们蛋白含量过高，与RNAlater 混合后易形成不溶的沉淀。
细菌
RNAlater 是抑菌的，虽然细菌在RNAlater 中不能生长，但细胞仍保持其完整性。大肠杆菌保存在RNAlater 中4℃条件下1 个月仍很完整，产生不降解的RNA。
3. RNAlater 中样品的保存
保存于-80℃
建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后从RNAlater 溶液中取出样品保存于-80℃。对于组织培养细胞，不必移去RNAlater，只需简单冻存整个溶液。实验证明，细胞在-80℃条件下冻存于 RNAlater 溶液中并未出现溶解。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。
保存于-20℃
建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后转移到-20℃。样品在-20℃条件下不会冻结，但在存贮缓冲液中会有结晶形成，这并不影响随后的RNA 提取。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA 的质和量都不会受到影响。
保存于4℃
目前尚无证据证明样品存于4℃ 1 个月内会出现RNA 降解。
如果没有冰箱：
将样品放在尽可能冷的环境中。如果周围温度超过25℃，应尽可能使RNAlater 中的样品冰浴数小时。
4. RNAlater 中样品的RNA 提取
组织
用消毒镊子将组织从存贮溶液RNAlater 中取出，浸泡在RNA 提取溶液中。一旦将组织放入RNA提取溶液中，匀浆一定要迅速进行。
细胞
从存贮在RNAlater 中的细胞中提取RNA 有两种操作方法可供选择：去除RNAlater 或者从细胞与RNAlater 的混合物中直接提取RNA。
5. 从RNAlater 中取出样品
去除RNAlater
因为RNAlater 的浓度比典型的细胞培养介质的浓度高，因此用通常沉淀活细胞的离心力无法沉淀RNAlater 中的细胞。离心沉淀细胞，去除RNAlater。（HeLa 细胞大约需要3000×g，但其他细胞可能不能容忍这个速度，或者他们需要更大的离心力。）
从RNAlater 中的细胞直接提取RNA
作为选择，我们可以用一步法破碎/提取溶液（如TRI Reagent 和RNAwiz）从没有去除RNAlater 的细胞中纯化RNA。这可通过向细胞混合物中加入10 倍体积的一步提取溶液完成，其他照常。

RNAsecure：
1.简介
在分子生物学试剂中用的RNAsecure 代替DEPC，有很多优点：
1) 可以加入到不能用DEPC 处理的溶液中（如：Tris 或MOPS 缓冲液）；
2) 可以加入到不能被高压灭菌的溶液中；
3) 可以加入到加酶之前的酶促反应中。有RNAsecure 试剂存在的如下酶促反应（先于酶加入）：RNA 多聚酶T7，T3 和SP6 的体外转录（37℃），MMLV 和AMV逆转录（42℃），以及SuperTaq PCR（94℃），均没有出现酶抑制现象。
2. 使用方法
1) 用缓冲液或经过处理的溶液稀释RNAsecure 试剂到1×，充分混匀。
2) 将混合物在60℃水浴温浴20 min，冷却至室温。这样的溶液可备用于接下来的RNA 提取和分析，或者保存于室温、4℃或-20℃以备将来使用。
3) 为了消除任何可能发生在经过初处理之后的RNA 酶的污染，在使用前可以将RNAsecure 溶液在60℃水浴中重新温浴10~20 分钟。
3. 注意事项
RNAsecure 试剂只在高于45℃的条件下才有活性，但当反应体系孵育温度超过该温度时可能会使一些酶失活。因此，用RNAsecure 处理反应缓冲液时要以加入酶之前做为临界点，然后进行酶促反应时孵育温度低于45℃。注意：这不适用于Taq 多聚酶。
五、样品制备常用仪器和试剂及耗材
1. 常用试剂及耗材
DEPC
TRIzol Reagent
氯仿：异戊醇
一次性注射器及针头
Qiagen RNeasy Mini kit
Qiagen RNAlater
Ambion RNAsecure Reagent
Tip（RNase-free）
微量离心管（RNase-free）
2.样品制备过程中使用物品的RNase-free处理
RNase-free 水：0.1%DEPC 处理（用磁力搅拌器搅拌过夜），高压灭菌。
氯仿
无水乙醇(新包装开封后注明RNA专用)
75%乙醇：用RNase-free 的水配制。
离心管和冷冻保存管以及Tip头浸泡在0.1%DEPC 水中过夜，干燥后高压灭菌。
其他玻璃或金属器具用铝箔纸包裹后180℃干烤过夜。
任何接触样品的操作需佩戴一次性手套,避免直接接触样品。

---

佳木斯市17540304379： 提取RNA的血清如何冻存 - ？
后苛东药：[答案] 、组织样品采集 1. 首先准备好用于包装样品的铝箔或冷冻保存管,并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样品编号. 2. 准确切除所需组织. 3. 离体新鲜组织,立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型. 4. 在RNase-free 的0.9%生...

佳木斯市17540304379： trizol法提取血中的RNA,怎样做量会更多？
后苛东药： 1 血要新鲜.如果是冻存的,在解冻时要完全,之后再加Trizol. 2 可以稍多加一些Trizol,少加些血.混匀之后放置10分钟左右,直接加三氯甲烷,混匀再去离心. 可以不用先离心去沉淀之后再加三氯甲烷. 3 每个步骤操作要快,用的时间药短些,防止降解 4 异丙醇沉淀的时候,放-20°C的冰箱半个小时,或再适当延长一点时间.迅速离心,之后加75%乙醇.只洗一遍,洗2遍易损失部分RNA. 5 不要过分干燥,管内稍有点残余的乙醇也没关系.干燥一会就迅速加DEPC水少量.一般我都加的30.如果需要浓度高点可以少加水. 6 提取RNA之后迅速反转录成cDNA再保存. RNA直接冻存会降解.也会影响以后反转的效率.

佳木斯市17540304379： 用于提取RNA新鲜组织如何保存 - ？
后苛东药： 市场上有一种非冰型RNA样品保存液.有些公司叫RNAwait,或者还有别的名称,你可以了解一下. 很多公司都有的. 非冻型组织细胞RNA保存液(RNAwait)是一种在较高温度下保存动物组织及细胞RNA样品的非冻型无毒溶液,它能迅速渗入细胞...

佳木斯市17540304379： mRNA提取注意事项 - ？
后苛东药： 1. 防止样本降解.液氮速冻或者RNALater保存液保存 2.防止RNA酶污染,可以加抑制剂 3.迅速操作 4.提取后尽快进行下一步实验,mRNA不宜存放于水溶液冻存.

佳木斯市17540304379： 准备做RT - PCR的组织,手术室收取后怎么保存?是不是要首先包在纸中? - ？
后苛东药： 找个5ml的冻存管装起来,最好放到液氮或者-70度冰箱,没有就-20的冰箱里保存,最好三个月之内提取RNA

佳木斯市17540304379： 如何从冻存的细胞提取RNA十万火 - ？
后苛东药： 1). 将冻存管从液氮或冰箱中取出; 2). 不待细胞溶解,将Trizol500ul-1ml直接放入冻存管中,此时Trizol会冻成冰状; 3). 将冻存管缓慢融化,并用加样器吹打混匀; 4). 将细胞裂解液移至Eppendorf管中,16000′g离心1min,吸出管底絮状...

佳木斯市17540304379： 在用液氮提取rna时,应该注意什么 - ？
后苛东药： 1)、准备冻存管、冻存盒放置需液氮中保存的样品. 2)、液氮中有三个取液氮容器,不宜直接将冻存管放于液氮罐中,这样会使 冻存管漂浮起来.固可用纱布、棉线将取氮容器口封住,保存样品. 3)、取样品时,需要使用研钵.研钵在使用前,需清洗,并用纯酒精灼烧以 充分灭菌.在研磨液氮保存的样品时,需加入液氮,迅速研磨,待组织变软, 再加少量液氮,再研磨.如此三次.可用消毒过的钥匙将研钵中的组织样品转入 EP 管中.介于所取的样品不能完全转移到 EP 管中,故而在取样时需多取样品, 以免不够. 4)、新买的液氮罐需用一定液氮进行清洗与预冷.固相对于10升液氮罐第一 次需定15升液氮.液氮可有效保存样品半个月.

佳木斯市17540304379： rna提取的样品要怎么处理?像不同细胞怎么处理?新鲜组织怎么处理?冻存组织又怎么处理?植物组织呢? - ？
后苛东药： 细胞就消化离心后加裂解液就可以了.组织的话就用液氮研磨后再裂解.我们一般用的试剂盒,方便提取.

佳木斯市17540304379： 想请教用过Trizol法提取RNA,且结果比较理想的详细步骤及注意事项,是否可以共享一下,谢谢 - ？
后苛东药： 我这边刚好在做,给你说下: 贴壁细胞的话去培养液,PBS洗一遍,加Trizol吹打下来.组织的话,在液氮里面捣碎,然后粉末放进Trizol,用超声粉碎器粉碎(超声每3秒,停10秒冷却,直到看不见组织碎末). (此步骤可以-80oC冻存,下面...

佳木斯市17540304379： 求助QIAGEN试剂盒提取总RNA的步骤?? - ？
后苛东药： 求助QIAGEN试剂盒提取总RNA的步骤样品处理:a. 植物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨,把粉末加入到1ml裂解液中混匀.b. 动物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液,用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理.c. 贴壁细胞:直接在培养板中加入裂解液裂解细胞,每106细胞加1ml 裂解液.用取样器吹打混匀.