高效液相色谱仪是如何工作的？
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9´107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
一、特点：
1.高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。
5. 适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于 400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：
1 .液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同，避免固定液流失)，有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。 LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大;但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。
a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。
b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。
c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相(见后)，可克服上述缺点。现在应用很广泛(70~80%)。
2 .液 — 固色谱法
流动相为液体，固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附(未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S)，可表示如下：
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式中：Xm--流动相中的溶质分子;Sa--固定相中的溶剂分子;Xa--固定相中的溶质分子;Sm--流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达平衡时：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]
3 .离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)
IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。
以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：
X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)
当交换达平衡时：
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系数为：
DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]
[讨论：DX与保留值的关系]
凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
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宜良县19153813887： 高效液相色谱仪器原理是什么? - ？
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宜良县19153813887： 高效液相色谱仪器怎么操作啊?简单吗? - ？
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宜良县19153813887： 高效液相色谱仪工作情况是什么我看到有色谱仪,有色谱柱,有进样针.是用进样针把待测物质打到色谱柱里吗?然后流动相不停的流,就把需要分析的样品... - ？
钭冒迪艾：[答案] 差不多 不过不是打到色谱柱里 是由流动相带入到柱子里面
宜良县19153813887： 最近做液相,想请问高效液相色谱仪器是如何操作的,新手!务必详细!谢谢,还有那些条件,数据,等~~ - ？
钭冒迪艾： 1、配制缓冲液 2、用滤膜过滤缓冲液 3、根据你的出峰时间需要,配制不同乙腈比例的流动相,比如说乙腈:缓冲液=1:6或1:4之类 4、将配好的流动相进行超声脱气15-20min 5、流动相配好之后,打开色谱工作站,设置方法,查看基线,并进行零点校正 6、取样进样检测
宜良县19153813887： 高效液相色谱仪器的结构及其各部分作用 - ？
钭冒迪艾： 1、溶剂输送系统;储液器,用来贮存数量足够、符合要求的流动相.配有溶剂过滤器,以防止流动相中的颗粒进入泵内.脱气器,脱气的目的是为了防止流动相从色谱柱内流出时释放出气泡进入检测器,从而引起噪声,不能正常检测. 输液泵...
宜良县19153813887： 如何操作高效液相色谱仪 - ？
钭冒迪艾： 这个没办法具体回答.因为不同的仪器品牌,不同的工作站操作方法都是不同的.简单地说,液相分为几个部件,这张图是安捷伦的液相,从上到下的顺序就是:流动相→泵→进样系统→色谱柱→检测器→废液1.操作的时候,就是把仪器打开,电脑打开,并且在电脑上打开工作站.工作站就相当于一个软件,它会自动和仪器连接.2.然后在工作站里面设置程序,比如,流动相比例啊,流速啊,检测波长了.然后运行仪器.3.仪器稳定之后,配样,同样设置程序,进样量,进样瓶等等,然后进样分析.4.这个时候仪器会采集信号,自动出图.5.结束之后就可以停止仪器,然后关机了.
宜良县19153813887： 高效液相的原理,最好详细点 - ？
钭冒迪艾： 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9'107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使...
宜良县19153813887： 高效液相色谱仪如何进行物质分离操作? - ？
钭冒迪艾： 通俗的讲就是化合物在固定相(色谱柱)和流动相之间不断的吸附和解吸的过程从而使不同的化合物得以分离,因为不同的化合物在这两者之间(固定相和流动相)的作用力是有差别的.
