gapdh内参出现两个条带
作者&投稿：原饶 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
纪葛18617035313问： 我想做PCR内参选beta - actin还是GAPDH好 - ？
衡阳县杞明回答： 常用的蛋白内参有 beta actin 和 GAPDH,它们是有区别的 GAPDH分子量为146KD,检测条带大约在36kD,beta actin分子量为42KD.一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上另外,细胞总蛋白的Western Blot的内参蛋白一般用 beta actin ,膜蛋白的Western Blot一般用GAPDH为内参
纪葛18617035313问： western blot 的内参不一致,急求助 - ？
衡阳县杞明回答： 要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot.因为Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化.虽然,顺利的时候Western Blot做起来...
纪葛18617035313问： PCR时小鼠GAPDH扩出条带而目的基因却扩不出是什么原因? - ？
衡阳县杞明回答： 既然其他样本有结果,说明引物没有问题.而该样本GAPDH也有,说明cDNA没有问题.PCR试剂也OK.一个解释,目的基因在这个样本中表达很低.如果是做定量的话建议用real time.这样肉眼看不到的也可以由荧光探测到.
纪葛18617035313问： 我的内参b - tubulin有两条带,怎么回事 - ？
衡阳县杞明回答：一般都是β-tubulin吧.另外GAPDH和actin也可以.
纪葛18617035313问： Western blot 内参跑不齐怎么调整 - ？
衡阳县杞明回答： 第一,应该确认每个样品表达GAPDH的量一样,虽然是持家基因,本人觉得不同细菌可能表达量不一样,造成信号强弱不一样.可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异,调整上样量一样再检测GAPDH. 第二,内参跑不齐.一般是跑胶...
纪葛18617035313问： GADPH是什么 - ？
衡阳县杞明回答： GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶,由4个30-40kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa.GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参.因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者...
纪葛18617035313问： 做RT - PCR内参的作用是什么?应该如何选择管家基因啊? - ？
衡阳县杞明回答： 内参的选择:普通PCR内参的大小没有多大要求,但real time一般选择300bp以下 它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时,加入的浓度可能会不一致,即使用分光广度计测其浓度,也会有仪器误差.PCR时,每个标本都要做对应的内参,...
纪葛18617035313问： 荧光定量的某个组织内参曲线峰偏了是什么原因?其他组织的峰单一,只有一个组织的内参GAPDH单峰偏了,. - ？
衡阳县杞明回答： 溶解曲线不止一个主峰1、引物设计不佳:避免二聚体和发夹结构的出现;2、引物浓度不佳:适当调整引物浓度;3、退火温度低:提高退火温度;4、镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度;5、模板中有基因组的污染:通过引物设计避免非特异扩增.
纪葛18617035313问： 做RT - PCR的时候为什么要设置标准反应体系和管家基因反应体系? - ？
衡阳县杞明回答： 在做QRT-PCR时,一定要有内参,即在PCR时,每个标本都要做对应的内参,而且每次都是看家基因,一般用bate-actin,有时也用GAPDH.内参的选择:普通PCR内参的大小没有多大要求,但real time一般选择300bp以下.它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时,加入的浓度可能会不一致,即使用分光广度计测其浓度,也会有仪器误差,跑出的条带要进行灰度分析.用目的基因的积分光密度比上内参的光密度就是你这个基因实际表达的量.希望对你有所帮助.
纪葛18617035313问： 反转录cDNA第一链,进行PCR扩增,只有引物二聚体,怎么办呢? - ？
衡阳县杞明回答： 两个原因:1、反转失败,模板里没有DNA;2、PCR失败,例如引物不行,退火温度不对等.这也没办法了,你先确定引物能不能从基因组里扩出条带.不过这种情况很可能是反转失败了.
