qpcr每一板上都要有内参吗
进行PCR为什么要选择适当的模板量
不适当会导致实验失败。基于以下的理论。1、每一个循环都会扩增一倍。2、引物扩增的效率一致。所以，如果结果X循环，产物得到了2的X次方。如果起始模板只有一半量，那产物就是2的（x-1)次方。如果起始模板的量是一倍，那产物就是2的（x+1）次方，以此类推。只要在产物指数增加的阶段测量扩增曲线，就...
pcr反应的结果都是产生所需的dna片段吗
pcr反应的结果都是产生所需的dna片段。PCR技术其实是一种体外的DNA产生扩增的技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将需要被扩增的DNA的片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经过一系列反应的多次循环，从而就可以在较短的时间内获得我们所需的特定的基因片段。
PCR为什么需要2条引物
PCR就是聚合酶链式扩增反应，因为DNA是双链，扩增时就需要同时扩增两条链，需要设计上游和下游引物，同时扩增DNA双链因为引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补； 另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸...
PCR反应原理是什么?
延伸（Extension\/Elongation）：在较高的温度下（通常约72°C，这是一般用于PCR的Taq DNA聚合酶的最佳活性温度），DNA聚合酶从引物开始沿着模板链合成新的DNA链。在这个过程中，每个单链DNA都复制成为两个双链DNA。这些步骤在一个PCR反应中会进行多轮（通常30-40轮），每轮都会使目标DNA片段的数量翻倍...
请问一下PCR中的一些技巧
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;在用作克隆目的的PCR 因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在...
学pcr技术需要哪些基础
引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条...
PCR的原理是什么,它有什么用途
PCR的原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。PCR最有价值的应用领域就是对感染疾病的诊断。理论上，只要样本有一个...
能用多个模板同时进行PCR吗
可以的，但在同一管里只能有一种样本的模板。一般是吧PCR除了模板意外所有的成分都加好后，在平均分到不同的ep管中，加入不同样本的模板。
生物专业人士 谁能帮我讲讲PCR板封膜的作用?
是在PCR之前，因为PCR过程中温度可达90°C以上，试剂溶液就蒸发完了。其实就是减小蒸发量，保存液体的作用。如果是用热盖加热的话，就不需要，下部加热，则需要。--- 一般来说短时间保存，肯定在冰箱，封住最好，防止空气中杂质的污染、蒸发。如果时间稍长，可以转移到离心管。
为什么需要加一组“DNA无模版”的PCR反应组。
因为PCR第一步要95度加热使DNA变性得到两条单链作为PCR扩展的模板，模板序列不同，所以PCR时要加一对引物。只加一对中的一条扩展速度只有一半。引物和模板在加之前离不离心跟以后有没有条带没有关系。pcr没有条带一般是因为各物质之间的比例或者退火温度不合适，你需要调整和优化。每换一种试剂都要...
蒲江县洛芬回答： 一个qpcr反应中是不是只需要一个探针引物就可以了 一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2*的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以.由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于...
陶欢18953994317问： northern blot 实验为什么要做内参对照 - ？
蒲江县洛芬回答： 内参通常选择18s rRNA,28s rRNA,或者U6 SnRNA,一方面起阳性对照的作用,另一方面这些内参基因表达量比较均一.你在比较不同样本的目的带是否有区别是,可以用内参的带作为对照.举例来说,你用qPCR得到如下结果:某种miRNA的表达量在肿瘤组织和癌旁组织中有差异;当你用northern进行验证时,如果两种组织样本内参的条带一样,而miRNA的目的带有差别,这样才能验证你第一种方法的结果.如果不做内参,就不能下结论,因为目的带的差异有可能是其他原因引起的,比如说上样量不一致.
陶欢18953994317问： 如何通过qPCR比较不同基因的表达 - ？
蒲江县洛芬回答： 提取样本mRNA,测提取的浓度,按比例调整浓度保持相近的起始量,做反转录合成cDNA,然后用配套的荧光定量试剂配置上样体系,就可以在Real Time-PCR仪上跑了,然后观察仪器上实时显示的数据和最终结果分析比较基因表达差异
陶欢18953994317问： “RT - PCR扩增目的基因cDNA”需要注意的事项有哪些? - ？
蒲江县洛芬回答： RT-PCR 是将 RNA 的反转录(RT)和 cDNA 的聚合酶链式扩增(PCR)相结 合的技术.首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA,再以 cDNA 为模板, 扩增合成目的片段.RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基 因表达水平...
陶欢18953994317问： 半定量PCR电泳图该如何理解?请高手指教 - ？
蒲江县洛芬回答： 1,不用.因为最后都要用内参基因作为标准,把浓度调到大概一致的,但最好不要差太多,方便之后调浓度.原理是内参基因的表达量一致,只要内参的带亮度差不多,我们就认为样品浓度差不多.2,我们都是用肉眼,别人我就不知道了.
陶欢18953994317问： 请教下大神,实时定量PCR(qpcr)实验,看扩增曲线的意义是什么? - ？
蒲江县洛芬回答： 你好,扩增曲线可以粗略地判断扩增效率.SYBR Green的双delta Ct法要求目的基因和内参的扩增效率基本一致.如果不一致,需要对公式进行修正,部分qPCR仪的配套软件可以做到,直接输入每对引物的扩增效率.但无论如何,保证高扩增效率是实验成功的关键.如果扩增效率一致,不同Ct的曲线显示出来就基本是平行的位移,其倾斜程度基本一致.而如下图一样,一条比较“陡”,另一条比较“平”,那么意味着扩增效率不一致.有可能是引物效率不一,或者个别样品、反应孔存在抑制PCR的污染等. 来自:肽度时界威客吴博士,有科研难题、科研需求就上肽度时界吧!
陶欢18953994317问： 酿酒酵母rt - qpcr内参用哪个基因 - ？
蒲江县洛芬回答： 最近我做了荧光定量PCR,每次做的时候溶解曲线效果就很差,不是单一的峰,说明是有非特异性的扩增,但是在普通PCR仪上做的PCR时,只显示了一条带,很清晰,是怎么回事啊?荧光定量的灵敏度太大了么?还有斑马鱼的内参基因怎么...
陶欢18953994317问： 关于PCR的问题有点糊涂 Real time PCR 和 RT - PCR(逆转录PCR) Q - PCR RT - QPCR - ？
蒲江县洛芬回答： 一般RT-PCR指的就是real time PCR,qPCR基本上与RT-PCR是等同的.没有见过RT-qPCR这样表述的.逆转录后再做PCR这是两个独立的过程,先做逆转录,再做PCR,这里的PCR可以是普通PCR,也可以是qPCR.做逆转录的时候一般是需要用管家基因作为内参的,但是qPCR不一定需要,要看你的目的.通过比较管家基因与目的基因在不同条件下的表达水平的差异,是常用的半定量方法,半定量也加相对定量.相应的有绝对定量,就是绘制标准曲线,测目的基因和病原体的拷贝数
陶欢18953994317问： qpcr怎么来检测microrna - ？
蒲江县洛芬回答： 提RNA你会吧... 反转录你会吧...如果只是检测一般的mRNA的表达量 就用poly T反转录就可以了 如果是特殊的必须去另外合成特异引物 如果你想得到确切的浓度值 那必须在做RT的时候检测一个标准品 就是这里面东西的浓度你是确切知道的 然后做一条标准品曲线 然后拿你要检测的那个得到的值带到那个曲线里面就算出浓度了 大部分时候都是检测相对含量 就是这个mRNA在不同东西里面的比较 那就不用做标准品曲线 直接把得到的几个值比较下关系就可以了 大部分检测用的内参都是GAPDH 其他还有U6 U7可选
陶欢18953994317问： rt - pcr目的基因和内参基因不在同一块板上可以吗 - ？
蒲江县洛芬回答： 半定量pcr内参基因扩增条件和目的基因扩增条件一样 以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本 中靶基因的拷贝数,称为定量PCR.根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,...
