做qpcr的dna浓度
qpcr原理及应用
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。3、由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接输出DNA...
氮循环功能基因相对丰度怎么测
测定氮循环功能基因相对丰度的方法主要是基于分子生物学技术中的定量PCR（qPCR）方法。具体步骤如下：提取样品中的DNA：从土壤和水样品中提取微生物DNA，可以使用多种方法如快速法和长时间法等，根据不同的样品特点选择合适的DNA提取方法。设计基因特异性引物：根据氮循环过程中所需的关键基因特异结构和序列...
qPCR引物加少了对结果有影响吗
会有影响。引物量加错了首先会影响引物的浓度，导致反应效率降低，其次如果你没有相应调整总体系体积，会增加反应效率降低的程度。同时也是最重要的结果就是你的各孔不均一，不符合PCR的实验要求。qpcr是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者...
QPCR是什么?它有什么特点和优缺点?
深入了解qPCR的魔力，首先，让我们揭开其神秘面纱。qPCR，作为PCR技术的升级版，它的核心原理是通过荧光信号追踪目标片段的扩增，从而定量分析基因转录水平。与传统PCR不同，qPCR更偏好于短片段的扩增，以确保高度特异性和准确性。PCR反应，这个基础技术，是DNA聚合酶在体外条件下复制DNA的接力赛。引物，作为...
科普讲堂 | 带你学习qPCR原理及应用!
荧光量子PCR——实时追踪分子变化的精密工具qPCR，全称为荧光定量聚合酶链反应，它是一种通过荧光信号实时监测PCR扩增过程的技术。相较于常规PCR，qPCR不仅关注最终产物，更关注每个循环中的动态过程。原理与实时监控在PCR反应体系中，荧光基团如SYBR Green I或TaqMan探针被巧妙应用。SYBR Green I结合双链DNA...
实时荧光定量PCR——RT-QPCR
目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等...荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法 SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）SYBR Green I是一种结合于...
rt-qpcr全称
该技术的核心步骤包括：首先，通过逆转录酶将总RNA或信使RNA转化为互补DNA（cDNA），然后使用cDNA作为模板进行qPCR反应。RT-qPCR的应用领域广泛，涵盖了基因表达研究、RNA干扰验证、病原体检测以及疾病相关的深入探究。通过了解RT-qPCR的基本原理和应用，你将能更好地掌握这一技术，并在分子生物学实验中得...
干货分享 | 招招解决qPCR曲线的疑难杂症
扩增曲线和熔解曲线是 qPCR 结果评估的关键。扩增曲线反映的是PCR反应过程中荧光信号随产物积累的变化，理想的曲线应呈现四个阶段：平稳的基线期、清晰的拐点、指数增长的扩增期和平滑的曲线。复孔间曲线的一致性也是重要标准。熔解曲线则通过观察温度升高时DNA双链解链的荧光变化，确认特异性扩增和是否存在...
秒懂RT-PCR、QPCR、Real-time PCR、real-time RT-PCR的区别
Real-time RT-PCR，即RT-qPCR，是这两个过程的结合，首先通过逆转录将RNA转化为cDNA（即从mRNA或总RNA模板），然后使用实时荧光PCR进行定量分析。这种技术不仅能检测cDNA，还能应用到基因组DNA等模板上，实现了定性和定量的双重功能。所以，理解关键在于区分它们的不同应用和功能：RT-PCR侧重于RNA到DNA的...
PCR原理 | PCR分类 | 引物设计方法
引物设计是PCR实验成功的关键，需遵循的原则包括引物长度、GC含量、Tm值、ΔG值、避免引物二聚体和发夹结构等。设计点突变引物时，需尽量突变最少的碱基数目以保持氨基酸序列的改变。在线设计工具如点突变引物设计网站，可以简化多点突变和缺失序列的设计过程。在设计qPCR引物时，需避免非特异性扩增和引物二...
藤县利君回答： 我们一般不去特意检测提取的得到的模板浓度,纯度倒是要注意一下,紫外分光达到1.8即可,不过我们一般也不去检测. PCR的时候可以设置梯度,分别加0.5μl,1μl,1.5μl,2μl,2.5μl,3μl. 不要低于0.5μl,也不要高于3μl.选择几个梯度做一下看看哪个效果好就用哪个.有时候为了省钱,就直接用1μl上去P,一般问题不大,出了问题再回头做梯度也不迟. 总而言之,使得模板量在1μl左右最好.
永叙13255888000问： q - pcr,关于cDNA加的多少量的问题 - ？
藤县利君回答： 这个没有明确的规定,一般用的最多的是1-100ng/ul(工作浓度).浓度太低和太好都会影响扩增效率,但并不是绝对的.因为有一些基因表达水平极低,有一些在特殊情况下又极高.qPCR很多时候仅仅反映的是几个样品之间的趋势,而不是绝对值.
永叙13255888000问： PCR时人模板DNA的量加到5μg会不会有点多? 用的是TaKaRa Taq,50ul的反应体系 - ？
藤县利君回答： 5μg的确有点多,看来你的DNA原液的浓度很高,一般PCR需要的模板量是有一定范围的,也是根据你要做的分子实验所需的PCR情况而不同的,模板量太高也许会有拖带或变性不完全现象,50ul你可以试着DNA终模板量为1μg或做几个不同模板量的梯度PCR,看看哪种效果最好,得以优化DNA模板量!
永叙13255888000问： 怎样算PCR扩增后的DNA质量 - ？
藤县利君回答： 如果你做的是非常靠谱的绝对定量RT-PCR,可以根据标曲算.但实际上对包括RT-PCR在内的PCR产物浓度定量,更简单、更靠谱的办法是:1,加标准marker电泳,用照胶自动分析系统计算,可以大致定量,得其质量浓度;2,更准的是,回收PCR产物,用紫外分光光度计准确测定其质量浓度.“先算出模板链的质量然后用2的N-1次方算出扩增后DNA的数量相乘”,这是有误区的,实际的PCR反应不是理想的指数扩增过程,尤其是循环到了一定次数后.何况,还要考虑特异性的问题.如有疑问,欢迎继续讨论,纯属手打,欢迎采纳,祝愉快!
永叙13255888000问： 做核酸的琼脂凝胶电泳分析时,根据测得的DNA图像如何判断DNA的含量,纯度和片段大小? - ？
藤县利君回答： 根据色带的深浅可以大概估计含量吧 根据杂带的多少可以判断纯度 根据和对比带(marker)比较,可以大概知道片段的大小这些都不准确,建议做个荧光定量pcr,克隆,和测序
永叙13255888000问： 模板的浓度对PCR有什么影响,一般要多大浓度? - ？
藤县利君回答： 那要看你用的是什么模板了. pcr的灵敏度很高,几pg的DNA就能检测出来了.一般用pcr产物或者质粒做模板,只需要1ng左右就可以了,如果是基因组或者cDNA做模板,模板量可适当增加.
永叙13255888000问： 什么是q - RT - PCR技术 - ？
藤县利君回答： 【q-RT-PCR技术】就是结合了荧光定量技术的反转录PCR(反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程,是DNA生物合成的一种特殊方式):先从RNA反转录得到cDNA(RT),然后用Real-time PCR进行定量分析(qPCR). 【...
永叙13255888000问： 要配置多少的酶切体系,载体和插入DNA的量要加多少? - ？
藤县利君回答：[答案] 因为内切酶的酶活性单位定义是在50ul反应体系中,最适温度反应1小时能够讲1ugDNA完全酶切的酶量.所以,一般在酶切体系里,DNA的量是可以加到非常大的.因为考虑到后期的纯化后DNA的损失问题,所以推荐酶切体系中的DNA尽量多加一些....
永叙13255888000问： 一个qpcr反应中是不是只需要一个探针引物就可以了 - ？
藤县利君回答： 一个qpcr反应中是不是只需要一个探针引物就可以了 一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2*的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以.由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于...
永叙13255888000问： 荧光定量基因拷贝数低和酶或引物有关系么 - ？
藤县利君回答： 没有阳性对照吗?如果内参的CT值不正常,那么很可能是你的qPCR体系的问题.内参正常的话,就有可能是引物或者目的基因丰度太低的原因了.引物的话,我们用的试剂盒推荐的浓度是25nM-900nM,是一个很广的范围了,我们自己也试过几个浓度,都可以.所以引物浓度并不是主要的问题,做做普通PCR看看能不能P出来,条带有多亮.
