平板克隆实验中途需要换液么

请问大神MTT测细胞增殖实验时，如果测一周时间，中间需要换液吗？具体怎么操作？谢谢~

测一周不换液细胞还能活吗？——MTT加进去之后只要4小时孵育时间就可加DMSO，之前的时间是刺激时间，应按实验要求自己掌握换液频率。
加DMSO之前的弃液：孔板离心机上先离心，然后快速扣板于滤纸上（贴壁细胞或者孔数多时）或者逐孔吸出（孔数少时）——重要的是要做对照；
还有一种不用弃液的方法：将DMSO换成同体积三联溶液；我们实验室做过比较，结果更精确；也不需要摇板子，但是要过夜之后测定OD值。

可以不加，有时候加了会有拮抗作用。1）24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day0：24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度

每隔3天进行换液，在换液时，缓慢加入培养基，避免吹起细胞。
一、6孔板：1。将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并计数，2。细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1，000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔），3。继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态，4。克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1，mL，4%多聚甲醛固定30-60，min，PBS洗涤1次，5。每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20，min，6。PBS，洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）。注意事项：1。每隔3天进行换液，在换液时，缓慢加入培养基，避免吹起细胞。2。染色完成后，务必将染液清洗干净，不要在孔中有残留。
二、平皿：1。取对数生长期的各组细胞，分别用0。25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）中备用。2。将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml，37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。3。置37℃、5%，CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。4。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。5。加纯甲醇或1：3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。6。去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟7。用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。8。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%注意事项：平板克隆形成实验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。数据分析：显微镜下观察阳性克隆，即每个克隆>50个细胞，相机拍照，数克隆数（大小约在0。3-1。0，mm）计算克隆形成率，并统计克隆大小。

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陆袁舒肝： 阴性平板上长几个克隆一般的原因是抗性板是筛选压力稍有不足.出现这种情况的原因可能是抗生素母液部分失效或者到平板时加抗生素时培养基的温度过高.你可以用新鲜的抗生素母液重新配置抗性板,如果还出现这种情况,还有可能是感受态细胞的问题.如果阳性实验平板上长的克隆比较多,可以继续挑单克隆摇菌做进一步验证.如果样品实验板上长的克隆也很少,可能是实验本身出了问题. 查看>>

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陆袁舒肝： 可能是平板有问题,也就是说平板上长的单克隆不是需要的抗性;可以用新鲜平板划线,如果能长,再从新平板上挑单克隆摇菌;如果不长,说明原来平板上的单克隆不对.

中站区17050747510： 最近在做分子克隆实验,培养出来的菌比较透明,长的比较的小,请问是什么原因造成的.？
陆袁舒肝： 分子克隆,转化后如果是过夜就取出来的平板,菌落可能不会长得很大.主要还是要看放置一段时间后,菌落形态是否有变化(可以在37C继续培养,如果怕长过了,也可以放在室温下).如果还是保持原来的状态,或者长出来更多的小菌落,则很有可能是污染.如果菌落明显在生长,而且透明度也变化了,应该是正常生长. 另外,如果这一批菌生长速度明显低于平常,需要考虑是不是抗性加高了,或者IPTG加高了,抑制了菌的生长. 最后如果形态与平常相似了,再做做PCR,抽质粒酶切确认一下.

中站区17050747510： ...能否继续在阳性平皿上挑单克隆?转化后涂布(已加抗生素),阴性对照培养皿上长有一两个菌落,能否在阳性对照的平板上挑取单克隆,进行后续的实验... - ？
陆袁舒肝：[答案] 阴性平板上长几个克隆一般的原因是抗性板是筛选压力稍有不足.出现这种情况的原因可能是抗生素母液部分失效或者到平板时加抗生素时培养基的温度过高.你可以用新鲜的抗生素母液重新配置抗性板,如果还出现这种情况,还有可能是感受态细胞...