在单克隆抗体中，为何需要多次检测细胞阳性，有何目的起何作用

在单克隆抗体中，为何需要多次检测细胞阳性，有何目的~

在单克隆抗体中，为何需要多次检测细胞阳性，
检测阳性，就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

分类：分子生物学知识 字号： 大大 中中 小小 1975年Kohler和Milstein首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。他俩首先创立了将能分泌特异性抗体的B淋巴细胞同无限繁殖的骨髓瘤细胞融合技术,为单克隆抗体的制备奠定了基础。这是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。

所谓的单克隆抗体是指由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别某一特定抗原表位的同源抗体。

单克隆抗体是经过人工制备的一类特殊抗体,它具有一般抗体的性质;它是B细胞增殖分化为浆细胞所产生的一类球蛋白,存在于体液中,具有免疫功能 ,介导体液免疫;它能与相应抗原(如病原体)特异性结合,在其他免疫分子和细胞的参入下发挥免疫效应.

单克隆抗体的本质是球蛋白,具有球蛋白的理化性质,空间结构和生物学活性.球蛋白对热和化学物质敏感,加热和加入化学试剂易破坏其结构,具有一定的半衰期.它和球蛋白一样具有可变区和恒定区,可变区结合抗原,形成抗原抗体复合物;恒定区有补体结合位点,介导补体发挥作用,形成攻膜复合物,杀伤变异的细胞.

单克隆抗体除了具有抗体的一般性质外,还具有其特殊性.它在结构和组成上高度均一,其类型抗原结合特异性和亲和力完全相同,易于体外大量制备和纯化,可以广泛的应用于医学和微生物学领域.单克隆抗体有小鼠免疫脾细胞(B细胞)和无限繁殖的骨髓瘤细胞融合在一起形成一个杂交瘤细胞.而这个杂交瘤细胞不仅具有无限繁殖的能力,还具有分泌抗体能力,因此在体外培养后,可无限的分泌抗体.

单克隆抗体的制备比较复杂,其中涉及多种生物学技术,在此简述其过程.用特定的抗原免疫纯系动物(如BALA--C小鼠),多次反复经背部皮下多点注射,每次注射应定量,也要注重接种的时间间隔,可适当的添加弗氏佐剂.经过一段时间的饲养后,选择血清抗体高的接种动物在无菌的情况下处死,取出脾脏剪碎,分离,离心取其悬浮细胞置入培养皿中,备用.在另取纯系小鼠的骨髓瘤细胞放进培养皿中,加入一些饲养细胞(如胸腺细胞,巨噬细胞)促使其生长,在该混合液中有多种细胞,为了提取目的细胞--杂交瘤细胞,必须进行HAT选择,培养获得纯代杂交瘤细胞.在众多的杂交瘤细胞中,有的不表达免疫球蛋白,有的表达其他类型的球蛋白,因此,要用特异性的检测方法从众多的细胞中筛选出阳性杂交瘤细胞.将目的细胞分离成单个细胞让其克隆化形成细胞株,再转移至其他培养基中扩大培养.为了大量的获得抗体,还需要经过小鼠腹腔接种,然后从腹水中分离提纯抗体.

单克隆抗体的分离,提纯,检验.将体外扩大培养液或者小鼠腹腔接种的腹水装入离心管中置于离心机上高速离心,取其上清液置于玻片上,加入相应的抗原,看是否有凝聚现象.

单克隆抗体问世后取得了辉煌的成就,如应用白喉外毒素单克隆抗体治疗白喉棒状杆菌;应用抗内毒素类脂A的单克隆抗体治疗G~菌败血症等.单克隆技术也因此获得了1984年的诺贝尔医学奖.它的主要作用是:用单克隆抗体代替多克隆抗体克服了交叉反应,提高了免疫学实验的特异性和敏感性,从而促进了医学检验学的发展;用单克隆作亲和柱,可分离提纯含量极底的可溶性的抗原,如激素,细胞因子和难以纯化的肿瘤抗原等;为物质提纯开辟了一条新途径;制备的单克隆抗体识别细胞表面特异性受体,若将抗肿瘤药物(如毒素或放射性物质)偶连到其上,构建生物导弹,有望攻克人类顽疾--肿瘤.

单克隆抗体有广阔的发展前景,但有其局限性.单克隆抗体作为外源性的抗原,多次反复的注射后能促使机体发生免疫应答,产生相应的抗抗体,产生排斥现象,因此单克隆抗体应用于临床有其风险性,在紧急预防的情况下,可以慎用.

总之,单克隆抗体为人类在检验疾病,治疗疾病方面取得了重大突破,尽管它还有些弊端,相信在不久的将来人类会制备出更加优良的单克隆抗体,为攻克肿瘤作出更大的贡献!

单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域。

1 作为亲合层析的配体

单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。

2 作为生物治疗的导向武器

脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。

3 作为免疫抑制剂

抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。

4 作为研究工作中的探针

单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。

5 增强抗原的免疫原性

抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。

6 作为医学检验试剂

单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：

(1)诊断各类病原体

这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。

(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测

用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。

随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。

(3)检测淋巴细胞表面标志

用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。

(4)机体微量成分的测定

应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。

综上所述，单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于鼠源性，用于人类疾病的预防和治疗时会产生异种蛋白变态反应，大大限制了其临床应用价值。而且，鼠源性抗体在人体内半衰期缩短，生物活性降低。因此，人们一直致力于人源性抗体的研究，如用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；用EB病毒转化人的B淋巴细胞；用基因工程法制备嵌合抗体等。但都遇到相当的困难。以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库是近年来形成的最新方法。以该技术制备的抗体片段(Fab)是人源抗体，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发展和应用前景。

单克隆抗体综述

一、抗体的定义和第一代单克隆抗体（经杂交瘤细胞生产）

抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。70000之间，称为“重链”（H链）。轻、重链之间和两重链之间由二硫桥连接，这样的四链结构（L2H2）组成一个免疫球蛋白分子。550个氨基酸残基，相对分子质量在55000;抗体的基本结构如图所示，由四条肽链组成，其中两条相对分子质量较低的肽链约含210个氨基酸残基，相对分子质量约24000，称为“轻链”（L链）；另两条相对分子量较高的肽链约含450，其相应的抗体分别命名为IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。以重链抗原性差异来进行抗体的血清学分类：用分离纯化的各种重链免疫动物获得相应的抗血清，再通过免疫交叉反应等血清学检测方法，分析其结构的异同，反复的验证，最后发现人类有5类不同的重链，分别为）与多种细胞结合，(5)可能造成免疫损伤。IgG占成人血清中抗体总量的75%以上，是人类血清中主要的一类抗体，由B细胞产生，其功能结构也是研究最清楚的。它主要的生理功能有：(1)中和毒素和病毒，(2)凝集和沉淀抗原，(3)激活补体，(4)通过特异的膜受体（Fc单克隆抗体技术的应用是现代生物科学领域中的重要进展之一。单克隆抗（Monoclonalantibody，简称McAb）具有广泛的应用价值，它为生物学和医学等自然科学的研究开辟了新的途经。

二、 第二代单克隆抗体：经过基因重组的嵌合或人源化单克隆抗体

嵌合抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。嵌合抗体成功的例子有：

Rituxan：Idec Pharmaceutical/Genentech的小鼠抗CD20抗体，含人IgG1κ恒定区，用于治疗B淋巴瘤。它的抗淋巴瘤作用主要可能来自于补体作用、ADCC和诱导肿瘤细胞凋亡。

Remicade：Centocor公司的抗TNF-α抗体，用于治疗风湿性关节炎和节段性回肠炎。

Simulect: Novartis公司的抗CD25抗体，用于抗移植排斥。

Erbitux：美国Imclone公司的抗EGFR（Her-1）单克隆抗体，目前FDA已批准其用于治疗结直肠癌。

人源化抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。

成功的例子：

Herceptin：Genentech公司的抗HER2/neu抗体，用于治疗乳腺癌。

Synsgis：Medimmune公司的抗F抗体，用于治疗呼吸道病毒感染。

Zenapax：Protein Design Labs（PDL）/Roche的抗CD25抗体，用于抗移植排斥。

h-R3：古巴分子免疫学中心的抗EGFR（Her-1）单克隆抗体，用于治疗头颈癌。

三、 噬菌体展示抗体和全人抗体

（1）噬菌体显示技术制备人源性抗体

基于噬菌体可把抗体片段表达在外膜的能力而建立一系列的抗体文库，然后用目的抗原来筛选文库中相应的抗体片段，再经体外加工可形成有功能的完全人抗体。用此方法可制备针对简单或复杂抗原的单抗，并得到中等亲和力的抗体，但该方法需用高通量筛选。现有一些已进入临床II/III期研究，如Cambridge Antibody Technology（CAT）的D2E7和CAT-152，分别用于治疗风湿性关节炎和青光眼。D2E7是抗TNF-α单抗，现正由Abbott Laboratories开发。从其2002年6月份提供的临床III期数据看，有望于近期进入市场。

（2）转基因动物制备人源性抗体

抗体衍生物：有的研究者正在开发更容易生产和使用的单抗衍生物，最成功者当属宾夕法尼亚大学的Mark Greene。他在寻找抗体互补决定区CDR衍生的多肽小分子[16]，并成立了CDR Therapeutics（现属Xcyte Therapies）以加速其多肽生产的商业化。他的多肽有亲本单抗的亲和力和选择性，但作为小分子，多肽应无免疫原性，且更容易制备。

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
检测细胞阳性是避免分离过程中分离不纯，参入了没有杂交的瘤细胞或者其他B细胞。可以去除阴性瘤细胞和B细胞。

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郁南县15232245241： 在单克隆抗体中,为何需要多次检测细胞阳性,有何目的 - ？
褚到蛋白： 在单克隆抗体中,为何需要多次检测细胞阳性, 检测阳性,就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞. 杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化.通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养.采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增.经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存.

郁南县15232245241： 细胞工程中,制备单克隆抗体时,需要经过三次筛选检测,这三次的目的是什么? - ？
褚到蛋白：[答案] 记得只经过两次筛选 第一次是筛选杂交瘤细胞 第二次是筛选能够产生单一抗体的杂交瘤细胞 当筛选完毕就可以进行体内或体外培养了

郁南县15232245241： 在制备单克隆抗体是为什么要进行两次筛选 - ？
褚到蛋白： 第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞

郁南县15232245241： 为什么植被单克隆抗体要经过两次筛选 - ？
褚到蛋白： 第一次是筛选出杂交瘤细胞;但这些杂交瘤细胞中有些是不能产生抗体的,还有些是不能产生我们需要的抗体的; 第二次就要筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞.

郁南县15232245241： 为什么在制作单克隆抗体时,对已经选出的杂交瘤细胞还需要进一步的进行筛选啊??？
褚到蛋白： 以为用抗原刺激小鼠时在小鼠的脾脏中有多种效应B淋巴细胞,所以第一步筛选出来的杂交瘤细胞也就有多种,所以才要对进行第二次筛选,选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞

郁南县15232245241： 制备单克隆抗体过程,是需要两次筛选还是三次筛选?为什么? - ？
褚到蛋白： 两次. 第一次是筛选出杂交瘤细胞,第二次是筛选出能产生特异抗体的杂交瘤细胞.

郁南县15232245241： 单克隆抗体需哪2次筛选? - ？
褚到蛋白： 第一次筛选是在两细胞融合后 目的是选出符合要求的杂交瘤细胞 而第二次筛选则是在杂交瘤细胞培养后 此次筛选则是为了选出能产生符合要求的单一抗体的杂交瘤细胞 就是这样 这些内容在高三生物课本第七十二页有详细叙述

郁南县15232245241： 利用细胞………单克隆抗体时有两次筛选,第一次筛选的目的是?第二次筛选的目的? 过程中有两种酶是什么? - ？
褚到蛋白： 在进行单克隆抗体实验时,第一次筛选的目的是为了把与骨髓瘤细胞结合的效应B细胞与其他普通的细胞分离开来,用的是特定的选择培养基.而第二次筛选是为了把我们真正需要的杂合效应B细胞提取出来.在我的印象中好像没有用到什么酶,筛选用的都是选择培养基.

郁南县15232245241： 单克隆抗体中两次筛选分别是什么方法 - ？
褚到蛋白： 第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,用连续注射抗原,下面具体介绍一下: 1、在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴...

郁南县15232245241： 在免疫过程中为什么需要多次向健康人体注射特定抗原 - ？
褚到蛋白： 是这了让这人产生更多的抗体和记忆细胞.