pcDNA3.1重组质粒用脂质体转染原代培养细胞能稳定表达吗
pcDNA3.1重组质粒用脂质体转染原代培养细胞能稳定表达
真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达
【摘 要】 目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme,BACE）基因的真核表达载体,为修复阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)损伤神经元奠定基础.方法 采用RT-PCR方法,从人的成神经细胞瘤的总cDNA中,扩增出1.5kb的BACE cDNA片段,再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况.结果 人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中；经脂质体转染COS-7细胞后,并由潮霉素进行筛选,可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-BACE的真核表达载体,为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE,为治疗AD奠定一定的实验基础.
需要看你的目的，如果是做过表达，印象里有文献是这么做的。
需要留意你的质粒类型还有目标分子的构建哈。
真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达
【摘 要】 目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme,BACE）基因的真核表达载体,为修复阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)损伤神经元奠定基础.方法 采用RT-PCR方法,从人的成神经细胞瘤的总cDNA中,扩增出1.5kb的BACE cDNA片段,再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况.结果 人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中；经脂质体转染COS-7细胞后,并由潮霉素进行筛选,可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-BACE的真核表达载体,为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE,为治疗AD奠定一定的实验基础.
DNA指纹的应用及相应的案例
1988年,我国伍新尧等〔12〕根据DNA指纹是人基因组中重复序列的RFLP的原理和人与鼠的髓鞘碱性蛋白(MBP)基因cDNA同源序列性高于90%的事实,选用鼠MBP cDNA3...3.2.1 生物种群学研究 利用DNA指纹图可以估算连锁不平衡,比较等位基因的频率,还能估计不同个体之间的重组率,在种群学研究上有助于建立某一个体在种群中的...
质粒和目的基因能够成功拼接的基础是为什么是DNA分子结构相同?
相同的分子结构就可以进行碱基互补配对，就可以直接连接。
HIV核酸检测的HIV核酸检测方法及程序
扩增靶核酸位置是pol(整合酶)基因区,可扩增HIV-1基因M组的A-G亚型和0组病毒,尤其可检测M组C基因亚型和一些重组病毒。检测线性范围是50～1,000,000 ...3.1.4 从每个一、二级集合管中吸取500mL集合样品,分装至另一相应标记的离心管,用超敏感核酸检测试剂进行检测。3.1.5 制备阴性集合外部质控品:使用50份HIV...
请教DNA指纹鉴定的实验怎么做,急
3.2.1 生物种群学研究 利用DNA指纹图可以估算连锁不平衡,比较等位基因的频率,还能估计不同个体之间的重组率,在种群学研究上有助于建立某一个体在种群中的地位和关系,特别是对真菌的种群研究,有很多真菌可以通过有性和无性的方式繁殖,但是何时以何种方式繁殖,程度如何,并不清楚,而利用DNA指纹图就能区分以有性和无...
农学考研 化学、植物生理与生化 考试真题及答案
《315农学化学无机及分析化学部分》百度网盘免费资源下载 链接: https:\/\/pan.baidu.com\/s\/14yvEFYj2V6CsMnjcaEQLEw ?pwd=gfk8 提取码: gfk8 2015考研农学统考《315农学化学无机及分析化学部分》考点精讲及复习思路【杨正亮 30课时】第21讲 氧化还原反应和氧化还原滴定法（一）【优优视频教程网 ...
动物胚胎干细胞的应用
利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作,通过细胞核移植生产遗传修饰性动物。有可能创造新的物种; (3)利用ES细胞技术,可在细胞水平对胚胎进行早期选择。这样...3.1 使人类ES细胞与猪等动物的胚胎嵌合,通过人、猪嵌合体动物为人类提供可移植器官。这样,可以克服异种动物器官移植所出现的免疫排斥反应。 3.2 定向诱导人...
求助:请高人推荐一本好的基因方面的书。要求一定要讲解各种文库的建立...
5.2 重组体的鉴定 5.3 将噬菌体DNA引入细菌细胞 5.4 重组噬菌体的鉴别 5.5 将DNA引入非细菌细胞 推荐阅读材料 第6章 大肠杆菌的克隆载体 6.1 基于大肠杆菌质粒的克隆载体 6.2 基于M13噬菌体的克隆载体 6.3 基于λ噬菌体的克隆载体 6.4 λ载体和其他高容量的载体使基因组文库得以建立 6.5...
细胞因子检测方法哪位了解,好一些的生物学科网有哪些
(2)逆转录PCR(RT-PCR)法技术:可快速、灵敏地检测表达很低的CKmRNA，并可同时测定同一样本中多种CKmRNA，操作过程包括细胞因子产生细胞的RNA提取，mRNA经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增。根据定量CKmRNA方法和原理的不同，可分为半定量PCR法，竞争性定量PCR法，...
关于 如何保护濒危物种的生境脆弱性 的论文
3.2 建立遗传基因库就是一个可行并且已初见成效的手段。所谓基因库就是一个群体中所有个体的基因型的集合，几乎包含了该物种的所有遗传信息。基因资源库主要包括生殖细胞库、体细胞库、基因组DNA文库和cDNA文库等几个子基因库，其中DNA由于是遗传信息的直接物质载体而最为重要。可以预见未来给DNA测序将...
严重联合免疫缺陷病是什么病?怎样治疗能治愈?
现在主要是严重的联合免疫缺陷病，对身体影响很大。身体免疫力低下，易受细菌或病毒感染。因此，对身体的伤害是很大的。我们需要去医院检查并选择使用药物来增强免疫力。这种病可以通过注射或手术治疗。治疗应该根据病人的情况来决定。最好听从医生的建议配合治疗。严重联合免疫缺陷病是一种罕见的遗传性疾病。
窄妍广东： pcDNA3.1重组质粒用脂质体转染原代培养细胞能稳定表达 真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达 【摘 要】 目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme,...
武陵源区19136389654： pcdna 3.1 转染哪种细胞 - ？
窄妍广东： pCDNA3.1含有复制子——SV40 ori,是来源于SV40病毒的复制子,可以转染所有的人源细胞,其实不止人源细胞,小鼠、猴子等动物的细胞都可以,没有特定的细胞株要求.pCDNA3.1的主要功能就是在动物细胞或者动物体内表达重组蛋白.当然,它还含有pUC ori,也可以转化大肠杆菌用于质粒的克隆与制备.
武陵源区19136389654： pcdna3.1作为载体的重组质粒转入大肠杆菌怎么检测筛选 - ？
窄妍广东： pcDNA3.1本身就有抗性,可以用抗性培养基进行初步筛选,然后长出来的克隆筛选,一般为三种:1.设计扩增外源基因片段的引物,进行菌液PCR2.提取质粒,做质粒双酶切--Hind Ⅲ和EcoRⅠ(这个最为准确)3.设计引物做测序
武陵源区19136389654： 我要做脂质体转染到3T3 - L1细胞看是否质粒会 表达. 但是3T3 - L1买来是一瓶的..没养过.. - ？
窄妍广东： 你买来之后你自己要培养,满满的一瓶先分瓶吧,大概培养到细胞的对数生长期,或者汇合度大概在60%-70%左右的时候可以进行保种.保种之后最好复苏一管用来检验.你脂质体转染如果用的是lipofectimin2000的话,步骤网上一大把.我用过lipofectimin2000和vigrous的,步骤都可以再网上查到的.你转染后也要分为瞬时转染和稳定转染的.稳定转染需要用抗性进行筛选,希望转染的质粒和基因组进行重组结合.瞬时转染的话,大概在48小时的样子,效果会比较好,不过这个不同的细胞是不一样的,需要你自己摸索下了.
武陵源区19136389654： 简述转化,感染,传导和转染间的区别 - ？
窄妍广东： 转化、感染、传导、转染和都属于分子生物技术,并且都是将外源基因片段导入受体细胞,容易使人混淆,区别如下: 1、转移物 转化:外源基因 感染:外源基因,但侧重于入侵的过程 传导:外源基因 转染:游离核苷酸 2、载体 转化:重组质粒 感染:重组病毒载体,但侧重于入侵的过程 传导:重组病毒载体 转染:重组质粒载体,脂质体 3、受体细胞 转化:原核细胞(如细菌) 感染:真核细胞或原核细胞,但侧重于入侵的过程 传导:真核细胞或原核细胞 转染:真核细胞 4、介导方法 转化:直接导入 感染:直接导入,但侧重于入侵的过程 传导:间接导入 转染:在脂质体等介导下进入 参考资料 搜狗百科-分子生物技术基因导入
武陵源区19136389654： 如何提高转染效率(转染,质粒,质粒转染,脂质体 - ？
窄妍广东： 如何提高转染效率(转染,质粒,质粒转染,脂质体 转入质粒的原理:质粒上连的片段转录后能够自身互补形成双链(shRNA),在细胞内被细胞自己剪切成siRNA. 两种转染方法在功能上是一致的.但是siRNA转染以后发挥作用的时间较短,用于短期抑制试验(一般维持一周以内).而因为质粒存在于细胞内比较稳定(载体上含有抗生素标记,可以筛选),能够持续表达产生shRNA,然后不断产生新的siRNA,因此维持作用的时间长(可以超过两周). 另外用质粒还可以同时转入报告基因作为对照,确定质粒确实已经转染进去了.
武陵源区19136389654： 质粒连接时,怎么筛选正向连接? - ？
窄妍广东： 一、 连接反应 1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号. 2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中,加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段. 3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链.将混和物冷却...
武陵源区19136389654： 用质粒好还是还是质粒脂质体共转染还是腺病毒好些 - ？
窄妍广东： 转入质粒的原理:质粒上连的片段转录后能够自身互补形成双链(shRNA),在细胞内被细胞自己剪切成siRNA.两种转染方法在功能上是一致的.但是siRNA转染以后发挥作用的时间较短,用于短期抑制试验(一般维持一周以内).而因为质粒存在于细胞内比较稳定(载体上含有抗生素标记,可以筛选),能够持续表达产生shRNA,然后不断产生新的siRNA,因此维持作用的时间长(可以超过两周).另外用质粒还可以同时转入报告基因作为对照,确定质粒确实已经转染进去了.
武陵源区19136389654： 如何提高脂质体转化细胞效率 - ？
窄妍广东： 1. 保持细胞状态良好,处于对数生长期2. 质粒与脂质体要达到最佳比例,一般质粒与脂质体是1:33. 确保脂质体未变质4. 操作时候的动作强度与手法
武陵源区19136389654： 重组质粒转化之前需要酶切验证吗 - ？
窄妍广东： 重组质粒转化之前需要酶切验证 重组质粒是把载体质粒酶切开,连接上PCR片段,然后转化感受态细胞,培养后提质粒获得的,这一系列过程中都无法检测目的基因是否连接成功了,是否转化成功了,只有对转化后的菌再次提质粒、酶切检测或PCR检测才能确定前边的步骤是否成功. 测序是更准确的方法,一般不用而已.
