3种基因文库的构建中对重组子的筛选方法并简述其原理
蓝白斑筛选的原理 分类:生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
还有一个是应用抗生素抗性原理。质粒载体一般都带有抗生素抗性基因，当其携带目的基因转化入宿主细菌时，使宿主也带有抗生素的抗性。置于含抗生素的培养基中培养，能够生长的就是含重组子的细菌。
新华网2007年8月29日消息 云南省农科院生物技术与种质资源研究所目前为该省分布的3种野生稻建立了基因文库。
云南省农科院生物技术与种质资源研究所副所长程在全博士接受记者专访时表示，在优异种质基因发掘研究方面，研究所首次构建了普通野生稻、疣粒野生稻和药用野生稻cDNA文库和SSH文库，并从中发现和分离获得一大批野生稻重要功能基因cDNA。
此外，该所首次在国际上大规模分离出野生稻抗病基因同源片段，并在GenBank上注册登记新基因片段30个。并且首次从云南普通野生稻中分离克隆抗稻瘟病Pi－ta同源基因2个、抗白叶枯病Xa21同源基因4个，并开展了相关基因结构与功能、比较基因组学和亲缘演化关系的研究，极大地丰富了野生稻基因组学研究的内涵。
野生稻是水稻的原始祖先，被专家称为“植物中的大熊猫”，蕴藏着十分丰富的优良基因。世界上目前共有20种野生稻种，其中中国有3种，即药用野生稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中国野生稻在云南分布最广，生态类型多。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化——CaCl2法
第一节 概 述
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
2 影印筛选。利用核酸探针对具有目的DNA片段的宿主进行筛选。
3 营养缺陷筛选。宿主是营养缺陷型，重组子可使宿主获得营养补偿能力，从而起到筛选效果。
1 抗性筛选。利用培养基中的药物进行筛选。重组子可获得抗性。
2 影印筛选。利用核酸探针对具有目的DNA片段的宿主进行筛选。
3 营养缺陷筛选。宿主是营养缺陷型，重组子可使宿主获得营养补偿能力，从而起到筛选效果。
基因文库的筛选方法
基因工程中为什么要建立基因文库?基因文库是如何建立的?
目的：当我们要对某一基因结构和功能进行研究时，首先要获得此基因，最简便的方法就是直接从基因文库中获取。构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到载体中，从而获得含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组文库。打个比方让你建图书馆，你就得把...
NGS|文库构建全流程,从片段化到PCR扩增
基因文库，这座生物DNA片段的宝库，包含了基因组文库和cDNA文库的珍贵存储。构建的过程犹如一场精密的DNA舞蹈，从目标RNA\/DNA的片段化开始，经由逆转录（cDNA）的编织，再到接头连接（扩增）的高潮，最终抵达测序的终点。让我们深入探索每一步骤的精细操作。首先，片段化是构建的起始，如同精巧的剪裁，常用...
在基因工程中构建基因文库的原因是什么
把基因切成小段,之后我们就可以用上面的两种方法来获取目的基因了.总而言之,构建基因文库就是别人替你做好了切割的工作,并把它导入到细菌中去了,这样就节省了大量的人力物力.就像你去图书馆根据分类很容易找到你所需要的材料一样,比你漫无目的地找着一段话要快很多………就是这样的 ...
何谓cDNA基因文库?利用cDNA基因文库钓取目的基因有何优越性?
cDNA基因文库具有多种优越性：(1)对它的筛选比较简单易行。这是因为一个完全的cDNA基因文库比一个完全的基因组文库所包含的克隆种类要少得多，两者相差10～100倍。同时cDNA基因文库来源于mRNA，而mRNA具有特异性表达的时期和部位，恰当地选择mRNA的来源就有可能使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的...
cdna文库的构建方法是用某种生物发育的某个时期的mrna逆转录产生的cd...
（1）cDNA属于部分基因文库，构建方法是利用某种生物发育的某个时期的mRNA通过逆转录产生cDNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中． （2）切割DNA分子的工具是限制性核酸内切酶，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，形成黏性末端或平末端． （3）DNA连接酶根据来源分为两...
基因组文库中的基因为什么有启动子
文库的构建是将基因片段装载到一个载体中（质粒载体、噬菌体载体或者人工染色体），然后转化大肠杆菌、酵母或者噬菌体来构建的，而不是单单拿cDNA或者DNA片段（鸟枪法）来构建的。因此，你说的启动子、终止子和标记实际上就是相应的载体上的。构成文库的实际是载有很多目的片段的载体，而不单单是目的基因...
在构建基因文库中,一定要用到的酶是什么?请说明原因。
限制性核酸内切酶（切）和DNA连接酶（缝），都作用于3.5磷酸二脂键
在基因工程中构建基因文库的原因是什么?
之后我们就可以用上面的两种方法来获取目的基因了。总而言之，构建基因文库就是别人替你做好了切割的工作，并把它导入到细菌中去了，这样就节省了大量的人力物力。。。就像你去图书馆根据分类很容易找到你所需要的材料一样，比你漫无目的地找着一段话要快很多………就是这样的 ...
何谓基因组DNA文库?如何构建?
在不同细菌所包含的重组DNA分子内，可能存在不同的染色体DNA片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库。基因组DNA文库涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因文库后，需结合适当...
基因文库名词解释
基因文库构建的步骤：1、提取基因组DNA：从待测生物样本中提取出基因组DNA是构建基因文库的第一步。提取DNA的方法有很多种，包括商业化的试剂盒和手工提取方法。根据样本类型和实验要求选择适合的提取方法。2、断裂基因组DNA：将基因组DNA随机断裂成大小不一的DNA片段，可以使用酶切酶或超声波等手段。酶切...
窦鸿曲莱： 1 抗性筛选.利用培养基中的药物进行筛选.重组子可获得抗性. 2 影印筛选.利用核酸探针对具有目的DNA片段的宿主进行筛选. 3 营养缺陷筛选.宿主是营养缺陷型,重组子可使宿主获得营养补偿能力,从而起到筛选效果.
海宁市17531913304： 基因文库是怎么回事? - ？
窦鸿曲莱： 基因文库简单说就是将细胞中的所有DNA用酶切成小片段,并将每一段利用载体转入宿主细胞中,这样经过培养后,每一个菌株都含有一小段DNA,再利用特殊方法将要检查的目的基因挑选出来菌株,提取DNA后进行测序, 之所以用基因文库是因为,直接测基因组DNA,太大了,测不准,而利用载体进入宿主细胞之后,DNA片段可以随宿主细胞一起复制,可以得到很多相同的拷贝,方便检查
海宁市17531913304： 求助:分子生物学问题 - ？
窦鸿曲莱： CaCl改变膜通透性,使靶细胞转化为感受太细胞,促进转化.调控基因表达如利用基因工程在靶基因上游插入增强子,强化基因转录等.仅供参考.
海宁市17531913304： 基因工程中不同情况下获取目的基因的方法(强调:不同情况下) - ？
窦鸿曲莱： 1.基因合成:当目的基因较小<=60bp时,可用.2.基因组文库筛选:包括内含子的基因提取3.cDNA文库筛选:除去内含子的基因提取
海宁市17531913304： 说明构建文库时和作基因表达时应如何选择分子克隆载体和宿主菌细胞 - ？
窦鸿曲莱： 你问的这个问题比较难回答,以下希望对你有帮助 将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接,然后引入寄主细胞,再筛选获得重组的克隆,按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类. cDNA克隆是以mRNA为原材料,经体外反转录合成互...
海宁市17531913304： 为什么构建基因文库 - ？
窦鸿曲莱： (1). 质粒文库 质粒是最早用于基因克隆的载体.现已有各种适用于不同工作的如克隆、表达、测序等专用商品质粒.但在构建基因文库上,由于质粒相对较小并只能容纳比自身更小的片段,因此它不能用于构建核基因组文库,通常只用来构建短...
海宁市17531913304： dna重组子的筛选鉴定有哪些步骤 - ？
窦鸿曲莱： DNA重组技术步骤如下: 一、质粒DNA提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒. 二、制备重组DNA 在灭菌的1.5mL 离心管中,加入pQE-31质粒10mL(2mg/mL),2mL酶切缓冲液,1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液(各含10个单位),无菌双蒸水7mL...
海宁市17531913304： 如何筛选真正获得目的基因并能有效表达的重组子 - ？
窦鸿曲莱： 标记基因和目的基因是连在一起的. 用标记基因筛选基因载体的方法很简单,在表达载体上一般有两个甚至两个以上的标记基因,比如,一个是抗青霉素的基因,一个是抗四环素的基因,将目的基因插入到抗四环素的基因中,那这个表达载体就不能表达出抗...
海宁市17531913304： 如何从基因文库中找到所需要的基因? - ？
窦鸿曲莱： 从基因文库中筛选某一克隆的常用办法是分子杂交.首先把属于一个文库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养皿上以取得相当分散的菌落或噬菌斑,然后用硝酸纤维滤膜吸印,使培养皿和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆.同时另行制备...
