pet28a(+)
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印度尼西亚(程业明 余俊杰)
Terminalioxylon burmense Madel-Angeliewa et Muller-Stoll,1973,Kramer K.,1974b,10～13页,图版1,图194,图版2,图195,197～199,插图28a—d;时代:新近纪;产地:印度尼西亚苏门答腊;地层:? Terminalioxylon densiporosum Kramer,1974,Kramer K.,1974b,13～15页,图版2,图200～204,插图29a—d;时代:新近纪;...
和政县门冬回答： 最佳答案 回答者:匿名用户 时间:2009-08-28 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛?>>> pET-28(a)+质粒的拷贝数在细菌里本身就是很低,所以和其他质粒相比量会少一些,你可以多摇一段时间,16-18h都没有问题. 略微提高抗生素的浓度,有助于提高拷贝数.还有就是不要用BL21等表达菌提质粒,表达菌多没有endA-突变,质粒的完整性和保真性都不如DH5alpha,TOP10等菌,提取的质量也不高,因为碱裂解时会有大量的多糖干扰,质和量都不如DH5α和TOP10. 铺较高抗生素浓度的板子,重新划线,挑个大点的菌落再摇.培养时候也加大抗生素浓度.
傅拜17113682286问： pet28a 引物大肠杆菌表达载体pet28a的通用引物有哪些? - ？
和政县门冬回答：[答案] T7正向和反向2条引物
傅拜17113682286问： 重组质粒双酶切鉴定 - ？
和政县门冬回答： 既然你的质粒已经提出来了,那么感受态、转化等因素就不必再考虑了. 你看看双酶切后载体的位置有几条带,如果是两条,那说明酶切不完全,如果是一条,那说明酶切效率没问题. pET28a分子量为5.6k,你的插入片段为500bp,如果你的质粒完全切开,载体和插入片段的摩尔比为1:1,质量比就是5.6k:0.5k,跑胶后两条带的亮度比就是10:1,所以你目的条带很淡非常正常. 换句话说,你的实验一切正常,那条500bp的条带可能本来就应该那么淡.
傅拜17113682286问： 质粒电泳时3种构象移动速度比,以pet28a为例介绍,也就说说3条带大概位置, - ？
和政县门冬回答：[答案] pet28a是5369bp,电泳的时候看应该是在marker的5000之上有2-3条带,带之间距离挺近的
傅拜17113682286问： pet28a 引物 - ？
和政县门冬回答： 建议你做一个双酶切看看,你的目的条带是不是成功连接上了.你的pet28a的酶切位点是哪个,是不是连接出现了问题.即使连接成功了,还有可能是你的基因需要加入诱导剂才会正常生长.该质粒上有lac调控区,你的菌需要诱导不,确认一下.
傅拜17113682286问： 为什么双酶切pet28a老切不干净 - ？
和政县门冬回答： 展开全部- 1.pET28a提出来时分子量就很大,8kb左右,不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大,但双酶切后在5.5kb左右
傅拜17113682286问： pet28a是低拷贝质粒,当插入GFP后,会不会影响pet28a - GFP的荧光蛋白强度? - ？
和政县门冬回答： 这个主要是看你的GFP蛋白表达量的,和质粒拷贝数多少并没有多大关系.表达量低了,一般是和你的诱导条件有关,你需要优化你的诱导条件.如IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等等.
傅拜17113682286问： pET28a双酶切后连接目的基因,什么也不长 - ？
和政县门冬回答： pET28a双酶切后连接目的基因什么也不长可以考虑对DNA进行定量.一般来说,设计一个连接反应,载体量最少需要50~100ng,而外源片段的分子数是载体分子数的3~10倍(具体质量取决于你的载体或外源片段的大小).连接体系为10ul,转化时用一半(5ul)转化50ul感受态细胞(最好用购买的感受态细胞,感受态的效率有保证),留下另一半备用.最好设置各种对照,以方便分析失败的原因,包括空载体连接对照等.
傅拜17113682286问： pet28a载体中连在目的蛋白前的标签和酶切位点有几KD? - ？
和政县门冬回答： 3kd左右. 但是通常6*his带大量正电,使得跑SDS-PAGE时电泳行为异常. 所以这个3kd通过电泳是看不出来的.
傅拜17113682286问： pET - 28a容易表达吗? ？
和政县门冬回答： 本人针对PET系列表达载体的一些认识和理解: 第一,PET-28a表达载体具有T7启动子及lac调控子,需要较高的IPTG起始浓度才能启动有效表达,可使用1mM-2mM,而...
