pet28a重组蛋白大小

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福许18691071895问： 用pet - 32a做载体,自己本身的序列有44kda,表达的蛋白应该多大 - ？
南汇区艾力回答： 用pet-32a做载体,自己本身的序列有44kda,表达的蛋白应该多大1)噬菌体DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)是最常用的表达菌株,噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株,构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中,诱导蛋白的表达方式与lac启动子一样都是iptg诱导.2)表达菌株BL21(DE3)上带有lacI基因,T7 RNA 聚合酶编码基因以及lacUV5启动子,lacUV5启动子可以启动T7 RNA 聚合酶的表达;3)表达质粒如pET-28质粒带有T7启动子和编码阻遏蛋白lacI的基因,在插入目的基因后,lacI是失活的;

福许18691071895问： pet30a载体表达的蛋白分子量增大多少kda - ？
南汇区艾力回答： pet30a载体表达的蛋白分子量增大多少kda 加上前面的融合肽以及终止子之前翻译的一个肽段,最终表达的蛋白分子量是59KD左右 加上前面的融合肽以及终止子之前翻译的一个肽段,最终表达的蛋白分子量是59KD左右

福许18691071895问： pet28a是低拷贝质粒,当插入GFP后,会不会影响pet28a - GFP的荧光蛋白强度? - ？
南汇区艾力回答： 这个主要是看你的GFP蛋白表达量的,和质粒拷贝数多少并没有多大关系.表达量低了,一般是和你的诱导条件有关,你需要优化你的诱导条件.如IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等等.

福许18691071895问： 在原核表达蛋白时,由于用的是原核表达载体PET28a,属于卡那抗性,但忘加卡那了,这样影响大不大? - ？
南汇区艾力回答： 理论上影响是比较大的,原核LB培养不加抗生素的话,很容易出现丢失了带有外源基因质粒的生长速度比目的菌的生长速度...

福许18691071895问： pET32a 分子量是多少? - ？
南汇区艾力回答： 道尔顿一般在生物化学,分子生物学,蛋白质学中运用.用D表示,定义为碳12原子质量的1/12.跟物质的摩尔质量是相等的,1D=1/N g,N为阿伏加德罗常数 所以32.7g/mol

福许18691071895问： 为什么用IPTG诱导蛋白没表达? - ？
南汇区艾力回答： 质粒先测个序吧,这是基础,不然后面一切都白搭.我以前做个C端myc标签的真核表达载体,中间有移码了,但用anti-myc做Western仍能检测到微量的目大小的条带,而将移码缺失补上后,目的条带变强了很多.可能的原因是移码时发生了小比例的 ribosomal frameshift,表达出了类似大小的带myc标签的蛋白.而你的目的片段如果突变出个终止密码子什么的,也可能表达出微量蛋白的.

福许18691071895问： 我做原核表达,PET32a连入目的基因用的是BamHI和SalI两个位点,请问表达时目的蛋白的长度是目的基因加上载？
南汇区艾力回答： 这说明你的目的蛋白没有表达,因为PET32a空载表达的蛋白就有20KD左右,当然诱导时间长了表达量就会越大

福许18691071895问： pet28a载体中连在目的蛋白前的标签和酶切位点有几KD? - ？
南汇区艾力回答： 3kd左右. 但是通常6*his带大量正电,使得跑SDS-PAGE时电泳行为异常. 所以这个3kd通过电泳是看不出来的.

福许18691071895问： pET - 32a携带标签大小究竟是多少? - ？
南汇区艾力回答： xiewen83(站内联系TA)我也不知道,学习一下!zysshine(站内联系TA)6个组氨酸和19KD左右的硫氧还蛋白再加上你的 目的蛋白sin_007(站内联系TA)载体上有Trx.Tag , His.Tag , S.Tag. trx-tag 有12KD,2个HIS标签,每个有0.8KD,若...

福许18691071895问： 我们在做绿色银光蛋白GFP的克隆与表达时,用到的办法是酶切法,质粒分别为pET - 28a和N3质粒 - ？
南汇区艾力回答： 通常来说,胶回收和NaAc乙醇沉淀得到的片段应该测浓度或者检验电泳的.毕竟胶回收或者乙醇沉淀都会有损失,而且有时候这类纯化方法收不到核酸.另外下一步连接的时候需要对基因片段和载体进行定量,应该是3:1的时候连接效果比较好.所以才有了定量这一步,个人觉得测浓度和电泳必须做一个,要不连接比较不可靠.

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