流式细胞术怎么调节荧光补偿FITC/PE/PerCP/APC

流式细胞术怎么调节荧光补偿FITC/PE/PerCP/APC~

现在的机器都是自动调节，不过也要做好准备工作。我大致说一下原理。
做补偿调节，需要以下的样本，无任何染色的样本，分别是FITC， PE， PerCP还有APC单染阳性的样本，所以你这里需要一共5个管子。
在纯手工的年代，你需要画出这四个颜色两两配对的散点图，比如FITC-PE， FITC-PerCP， FITC-APC， PE-PerCP，PE-APC， PerCP-APC，这一共6个散点图。
然后，先上未染色的样本，调节各个荧光通道的电压，是细胞都位于各个散点图的左下角。

在记录前，把每个样本都先跑一边，目的是观察电压的设置是否正确。比如FITC和PE会有重叠，上FITC阳性管的时候，虽然其他通道会有些信号，但FITC通道的信号应该最强。如果发生了其他通道信号强于目的通道的情况，就要进一步调节电压，是目的通道的信号最强。这样把每一个单染的样本都过一遍，确保目的通道的信号最强。
现在的仪器软件，不需要你自己画这些散点图，但是调剂电压的这一步是必须的，可以在阴性对照管的页面下完成。
电压调节好以后，记录阴性对照和阳性单染样本的信号，然后机器会自动结算补偿值。
如果你要手工计算，这里是原则：
以FITC-PE为例。在散点图上，划分为四个象限。如果纵坐标是FITC， 横坐标是PE。调节电压后，阴性的细胞位于左下象限。这是可以得出阴性细胞横坐标（PE）和纵坐标（FITC）的平均荧光强度值。电压调好以后，上单色阳性样本。比如上牌FITC阳性，这时不要再改变电压了，而是调节补偿系数，最终目的就是让FITC阳性的细胞都位于向下象限，并且该细胞团的纵坐标（PE）荧光强度和阴性细胞团的值一致。其他颜色的两两补偿以此类推。

现在的机器都是自动调节，不过也要做好准备工作。我大致说一下原理。做补偿调节，需要以下的样本，无任何染色的样本，分别是FITC，PE，PerCP还有APC单染阳性的样本，所以你这里需要一共5个管子。在纯手工的年代，你需要画出这四个颜色两两配对的散点图，比如FITC-PE，FITC-PerCP，FITC-APC，PE-PerCP，PE-APC，PerCP-APC，这一共6个散点图。然后，先上未染色的样本，调节各个荧光通道的电压，是细胞都位于各个散点图的左下角。在记录前，把每个样本都先跑一边，目的是观察电压的设置是否正确。比如FITC和PE会有重叠，上FITC阳性管的时候，虽然其他通道会有些信号，但FITC通道的信号应该最强。如果发生了其他通道信号强于目的通道的情况，就要进一步调节电压，是目的通道的信号最强。这样把每一个单染的样本都过一遍，确保目的通道的信号最强。现在的仪器软件，不需要你自己画这些散点图，但是调剂电压的这一步是必须的，可以在阴性对照管的页面下完成。电压调节好以后，记录阴性对照和阳性单染样本的信号，然后机器会自动结算补偿值。如果你要手工计算，这里是原则：以FITC-PE为例。在散点图上，划分为四个象限。如果纵坐标是FITC，横坐标是PE。调节电压后，阴性的细胞位于左下象限。这是可以得出阴性细胞横坐标（PE）和纵坐标（FITC）的平均荧光强度值。电压调好以后，上单色阳性样本。比如上牌FITC阳性，这时不要再改变电压了，而是调节补偿系数，最终目的就是让FITC阳性的细胞都位于向下象限，并且该细胞团的纵坐标（PE）荧光强度和阴性细胞团的值一致。其他颜色的两两补偿以此类推。

流式细胞术中荧光补偿该如何调节？以FITC和PE为例来看光谱重叠。FITC单染管的荧光会部分漏到PE通道中，而这部分需要从PE通道中减掉溢漏过来的FITC荧光。那么荧光补偿该如何调节呢？l调节电压l检测荧光通道的自发荧光l每个荧光通道做单染管对照检测何为单染管对照？l细胞l补偿微球细胞通常是流式抗体单染管对照的样本首选，但是当细胞数量有限，无多余细胞用于抗体单染或感兴趣的表面抗原表达较低，阳性分群不明显不足以用来调节补偿时，建议选择补偿微球。补偿调节时要注意：l使用未染色的细胞做PMT的电压设置l不要使用未染色的补偿微球设置电压eBioscience提供两种补偿微球：OneCompeBeads与UltraCompeBeads。微球大小和淋巴细胞相当，可连接各种荧光标记的抗体来调节补偿。每滴微球中都含有两群：一群是可以结合抗体的阳性群，一群是不会与抗体反应的阴性群。优点：l使用方便，一滴即可l使用实验抗体与微球有效结合调节补偿，无需再用CD4分群来调节l细胞替代物，适应各种孵育时间，结果稳定流式细胞术中荧光补偿该如何调节？l能与各种种属和亚型的抗体反应ProductSpeciesCompatibilityChainRecognitionFeaturesMouseIgRatIgHamsterIgRabbitIgKappaLightChainLambdaLightChainOneDropOneVialAllcellsizesVioletLaserUltraCompeBeads01-2222√√√√※√√√√√√OneCompeBeads01-1111√√√√※√√√√√CompetitorXAnti-MouseIg,k√√CompetitorXAnti-RatIg,k√√CompetitorXAnti-Rat/HamsterIg,k√√√CompetitorXPlusAnti-MouseIg,k√√CompetitorXPlusAnti-RatIg,k√√CompetitorZAnti-MouseBeadKit√√√竞争品牌的微球是分种属的，使用不同抗体要购买多个产品以使用注：兔来源的抗体与微球结合力较弱，但某些还是可以使用l适用于各种激发光---适用于488nm蓝光，532nm绿光，561nm黄光，633-635nm红光，UltraCompeBeads尤其适用紫外(355nm)或者紫色(405nm)激光器l微球本身信号经过优化适合补偿调节l价格相当，有小包装操作步骤：1.准备好流式管，每种荧光抗体一个；2.将微球翻转或者涡旋混匀；3.在每管中加入一滴微球；4.在管中分别加入相应的1test抗体（不同抗体1test的用量不同，具体参见说明书）；5.敲击或者涡旋混匀；6.2-8℃暗处孵育15-30分钟；7.每管加2ml流式染色缓冲液，400-600xg离心3-5分钟；8.弃上清，每管加入0.2-0.4mL流式染色缓冲液；9.混匀后上机分析

现在的机器都是自动调节，不过也要做好准备工作。我大致说一下原理。
做补偿调节，需要以下的样本，无任何染色的样本，分别是FITC， PE， PerCP还有APC单染阳性的样本，所以你这里需要一共5个管子。
在纯手工的年代，你需要画出这四个颜色两两配对的散点图，比如FITC-PE， FITC-PerCP， FITC-APC， PE-PerCP，PE-APC， PerCP-APC，这一共6个散点图。
然后，先上未染色的样本，调节各个荧光通道的电压，是细胞都位于各个散点图的左下角。

在记录前，把每个样本都先跑一边，目的是观察电压的设置是否正确。比如FITC和PE会有重叠，上FITC阳性管的时候，虽然其他通道会有些信号，但FITC通道的信号应该最强。如果发生了其他通道信号强于目的通道的情况，就要进一步调节电压，是目的通道的信号最强。这样把每一个单染的样本都过一遍，确保目的通道的信号最强。
现在的仪器软件，不需要你自己画这些散点图，但是调剂电压的这一步是必须的，可以在阴性对照管的页面下完成。
电压调节好以后，记录阴性对照和阳性单染样本的信号，然后机器会自动结算补偿值。
如果你要手工计算，这里是原则：
以FITC-PE为例。在散点图上，划分为四个象限。如果纵坐标是FITC， 横坐标是PE。调节电压后，阴性的细胞位于左下象限。这是可以得出阴性细胞横坐标（PE）和纵坐标（FITC）的平均荧光强度值。电压调好以后，上单色阳性样本。比如上牌FITC阳性，这时不要再改变电压了，而是调节补偿系数，最终目的就是让FITC阳性的细胞都位于向下象限，并且该细胞团的纵坐标（PE）荧光强度和阴性细胞团的值一致。其他颜色的两两补偿以此类推。都要计算各个象限的平均荧光强度。

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永寿县19499099809： 流式细胞仪 - 调节荧光补偿是不是把其他颜色荧光都调到零是最好的? - ？
年眉麦角： 荧光补偿是因为每个荧光的光谱都比较宽.用你的例子来说,就是PI的荧光,不仅被PI这个通道的探测器所感应到,而且也同时被FITC的探测器感应到,所以一个PI染色会出现在双染的区域.另外FITC的荧光,也会同时被两个探测器所检测到....

永寿县19499099809： 流式补偿怎么调节 - ？
年眉麦角： 温度,压力补偿

永寿县19499099809： 用流式细胞仪检测各个象限的意义？
年眉麦角： 要看你是什么染料标记了 例如临床上,最常用的荧光染料主要有三大种: FITC、PE和PeCy5.肉眼观察,FITC为绿色;PE为橙色; PeCy5为红色.它们都在488纳米被激发.检测波长分别是:FITC是525纳米;PE是575纳米;PeCy5是675纳...

永寿县19499099809： 外周血细胞均含有gfp,另外还有两种其他荧光,流式细胞术应怎样调补偿 - ？
年眉麦角： 另外两种是哪两种呢?调节的是后你需要4个样本,一是不带有任何荧光的,一个是只带有GFP的,一个是只带有另外一个荧光中的一个的,另外一个是剩下的那种荧光的.也就是一个无荧光,其他单色荧光.

永寿县19499099809： 如何选择流式荧光 - ？
年眉麦角： 这个问题有点不好说,每个荧光都有自己在某个波长的最大吸收峰,原则上最大吸收峰差的越远补偿越小,FITC PE APC 最常用的三个荧光,一般一管染三种抗体就选这三个颜色,便宜,而且好染.如果再加的话可以选PE-cy7或APC-cy7,个人觉得可以,一管不宜染太多种抗体,到时候很难分析,补偿也大,结果不准确. 同时,建议你做原代细胞流式考虑染死亡细胞(7AAD).对了,最好不用Percy 5.5,不好染.高保真生物技术有限公司~实验整体外包服务商~~~

永寿县19499099809： 用流式细胞术测细胞凋亡用哪种试剂盒最好 - ？
年眉麦角： Annexinv-FITC在green通道检测,PI应该在红色通道检测,PI也可以在黄色通道检测但是得做荧光补偿.

永寿县19499099809： 如何看流式细胞术结果中的图 - ？
年眉麦角： 博凌科为解答:FCM数据的存贮的方式是FCS2.0(flow cytometry standard),采用列表排队(List Mode)方式.易于加工处理分析,但缺乏直观性,数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种;由数据还可以做出标准曲...

永寿县19499099809： 流式细胞术 cv值控制在什么范围 - ？
年眉麦角： CV是流式做仪器校准的时候,使用标准品的荧光微球来测量的.每个厂家的要求不一样.比如BD的CS&T要求是小于6%

永寿县19499099809： 流式细胞术散点图参数中FSC - A与FSC - H是什么意思 - ？
年眉麦角： fsc代表的是forward scatter,这个参数和细胞的大小成正比,A是area的缩写,H是height的缩写.这是机器在记录信号时所采用的参数(不显示在用户界面,在调试机器的时候可以显示) 每个细胞通过激光的时候,机器都会记录一个波状信号(...

永寿县19499099809： 流式细胞术常用试剂,激活剂及荧光标记物有哪些 - ？
年眉麦角： 最常用的的就是荧光标记的抗体,各种荧光染料.还有其他固定,通透细胞膜的试剂.荧光标记物常用的有几十种,比如FITC, PE等等,各个生产厂家还有自己的专利产品