细胞培养，被污染

困惑：细胞及培养基是被细菌污染了吗~

细胞培养中常见的污染情况总结如下:
1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理
2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作
3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。
5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。
真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。
污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等

关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。
也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状
态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。
1、孵箱应定期用三氧机消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水
2、超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素
3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染
4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。

细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性，多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。 五、非同种细胞污染
由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的，而现在却认为是HeLa细胞。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。 非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。 第二节污染来源及鉴别 一、污染来源
细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径。 1、不洁的动物组织标本
很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外)，但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。 2、空气
空气中含有大量的微生物，如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤气受尘埃堵塞，工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区，也会导致污染。春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。
3、清洗消毒
培养用物品、材料洗刷不净，培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。 4、操作
来自操作者的污染主要有以下几方面：
器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过，或者是否已经消毒灭菌处理过，或者虽经处理，时隔已久又末重新处理。
操作者未戴口罩、帽子，呼出气中排出细菌和支原体。

细胞污染？ 细胞产品专家齐氏生物建议您先搞清楚污染的原因
1）细菌（会出现培养液变混浊，pH改变，污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株丢失。）

2）真菌（可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。）

3）支原体（部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。 ）

可以从组织清洗、实验室环境灭菌、无菌操作规范等几个方向查找一下原因。

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原阳县17043686134： 如何消除细胞培养的污染及实验方法? - ？
进清瑞田：[答案] 细胞培养的污染通常只能采用避免的手段,操作仪器的消毒杀菌,超净工作台等等,培养过程中发生污染的话,只能再来一次了

原阳县17043686134： 细胞培养,被污染 - ？
进清瑞田： 细胞污染? 细胞产品专家齐氏生物建议您先搞清楚污染的原因 1)细菌(会出现培养液变混浊,pH改变,污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株丢失.)2)真菌(可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列.)3)支原体(部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落.但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染. )可以从组织清洗、实验室环境灭菌、无菌操作规范等几个方向查找一下原因.

原阳县17043686134： 为什么培养的细胞老是污染,我之前养都不会污染,就被 - ？
进清瑞田： 细胞污染以后最好是将细胞立刻处理掉,并将整个实验室进行清理. 细胞污染可能原因: 1. 天气太热,实验者在培养和接种或者换液时出汗(有空调稍好,但是手也出汗). 2. 培养间里可能暗藏污染原.3. 注意培养箱(这点最重要),仔细检...

原阳县17043686134： 我养的细胞是不是被污染了 - ？
进清瑞田： 不一定是,有的培养皿底部是有划痕的,所以你可能看到的是划痕..有一方法可以判断是不是污染,你继续培养两天,如果发现丝状物越来越多就说明是真菌污染.注意和其他的细胞分开培养..若不是,说明不是污染.

原阳县17043686134： 细胞培养细菌污染了加双抗第二天细胞都死了昨天观察细胞时发现被污染,有很多短线状大范围游动的东西,考虑是细菌,就用生理盐水把把细胞离心洗了... - ？
进清瑞田：[答案] 应该不是细菌污染,有其他污染吧,比如支原体等.洗了之后也不能去掉污染,刚开始状态好是因为污染物没有大量生长,以至于观察不到,看上去细胞状态也没受影响,之后越长越多逐渐影响细胞生长直至死亡.

原阳县17043686134： 细胞培养过程中污染的途径有哪些 - ？
进清瑞田：[答案] 实验人员的操作 细胞培养体系细胞培养环境细胞来源也会有所影响

原阳县17043686134： 在培养箱的细胞,别人的污染了,会影响我的吗 - ？
进清瑞田： 这是没有任何影响的,血液细胞是分化后的细胞,每天都有大量的死亡,随着时间的推移,输的外来血细胞都将被自身新形成的血细胞取代.外来血细胞是不会在体内永久存留的.DNA鉴定和输血间隔的时间一定要足够长.个人认为至少要三个月.

原阳县17043686134： 细胞培养实验如何消除组织培养的污染? - ？
进清瑞田： 重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染.首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器. 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平.这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要. 实验室自动化软件 http://product.bio1000.com/101181/