请学生物的同学帮忙介绍一下“PCR”

介绍一下 PCR~

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史
PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

PCR反应特点
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可

去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛？>>> 反向PCR（Inverse PCR或Reverse PCR）反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。

PCR
一、PCR概述
1、什么是PCR
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。
2、PCR技术发展史
PCR原理是由一对引物介导，能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增，经过n个热循环扩增，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0＜E＜1,扩增效率＝倍，使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。
聚合酶链式反应自从1993年到现在很快经历了四代产品：
 第一代：手动/机械手式水浴基因扩增
如上图所示，用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴，标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。这样PCR标本就能完成下述形式的热循环：
94℃ 30S 58℃ 45S 72℃ 60S
40次循环
这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件，事实表明实验效果还是不错的，但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中，因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰，影响结果。本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶（某些PCR反应需要多于三个温阶）、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94℃变性温度等。
为改进提高本方法的自动化水平，有人设计了机械手装置，替代上述手工移动标本过程，形成了机械手水浴式基因扩增仪，该改进解决了实验人员的高强度劳动问题，但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。这种类型的基因扩增仪在九十年代中期我国北京、上海有定型的产品销售，应用也较广，曾为我国的分子生物学的发展做出过积极贡献，而后便逐步被自动化程度更高的扩增仪替代，现在很少有单位使用。
 第二代：自动化控制型定性基因扩增仪
与上述水浴式扩增仪相比，也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪，它是最具代表性的扩增仪，包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分。
 第三代：终点定量/半定量
第二代的定性PCR只能判断阴性阳性，而无法评价特定核酸的浓度及定量分析，定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能：
•潜伏期病毒浓度探测
•感染程度
•致病病原体数量变化测定
•抗病毒药物疗效评估
•恢复期病毒载量检测
自从1996年美国ABI公司发明第一台荧光定量PCR仪以来，PCR技术和应用从定性向定量快速发展.终点定量PCR的优点是设备投资少，对于国内经济条件还不能购买昂贵实时荧光定量PCR仪的科研单位和医疗机构，利用现有的第二代常规定性PCR仪，在添加一台专用的单孔PCR终点产物荧光定量检测仪便可开始工作，起到定量的作用。终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的一个中间产品，而PCR终点产物荧光定量仪进口产品较少，国产仪器较多，如西安天隆的TL988，上海棱光的DA620型等
第四代：实时定量PCR
实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
见下图：(略)
2、实时荧光定量PCR的优势：
设备由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。
3、实时荧光定量PCR技术原理
所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲 线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义 样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。
4、实时荧光定量PCR技术在医疗方面的应用
⑴ 病原体检测：目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
如：结核菌基因诊断的意义主要表现在：
a.区分TB与其它分枝杆菌；
b.检测TB耐药基因；
c.提高TB的阳性检出率。
⑵ 产前诊断：到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
⑶ 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。如PCR技术在HBV检测中的应用及意义：
a.了解乙肝病毒在体内存在的数量。
b.是否复制。
c.是否传染，传染性有多强。
d.是否有必要服药。
e.肝功能异常改变是否由病毒引起。
f.判断病人是适合用哪类抗病毒药物。
g.判断药物治疗的疗效。
⑷ 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
(5)在优生优育中的应用:
近年来经济发展迅猛，人民生活水平逐年提高，对自身及家人特别是下一代的身体健康愈来愈重视。另外，由于国内计划生育工作逐步走向深化，独生子女比较多，孩子的身体素质更成为长辈们关注的焦点。因此，怎样提高新生儿质量改善人类遗传素质，即优生优育已显得非常重要。①避免有严重遗传性疾病和先天性疾病的个体出生。②增进体力、智力优秀个体的繁衍。其中避免有严重遗传性疾病及先天性疾病个体出生是优生优育最基本的内容。从临床优生学角度分析具体工作包括在母亲妊娠期间对母亲及胎儿进行遗传学检查尽量排除常见的遗传性疾病个体的出生，另外在妊娠期检查母亲是否患有某些易引起胎儿畸形的传染性疾病如弓型虫、风疹病毒、衣原体等感染。以往对遗传性疾病的检测主要使用染色体分析法，而临床绝大部分遗传性疾病是基因病而不是染色体病，染色体发析法不能检出的。若使用PCR基因扩增法联合单链构型多态性分析（sscp）、限制性片段长度多态性分析（RFCP）等位基因特异性寡核某酸（Aso）点杂交或差异PCR可以很方便地检出单个基因的突变而且其准确性可达95%以上，因此使这一问题得到了较好的解决。常见的易致胎儿畸形的感染性疾病原体主要有单疱病毒（HSVⅡ）、风疹病毒（RV）、人巨细胞病毒（HCMV）、弓形体（TOX）及沙眼衣原体（CT）。以往这些病原体感染诊断比较困难，主要靠培养法进行确诊，而培养法费时，代价昂贵，而且受到采样、样本保存及用药等因素的影响，基本不能在临床中推广。PCR基因扩增法因其高敏感性、高特异性非常适合这些疾病诊断及疗效跟踪，是最值得推荐的检验方法。
1、PCR基因扩增法在遗传性疾病产前诊断中的应用，遗传病是由于遗传物变化而引起的机体某一功能或缺陷或异常所致的疾病，其根本变化在于遗传物质。其类型包括单基因遗传病，染色体遗传病及多基因遗传病。遗传病诊断除询问病史，一般物理诊断，普通实验室检查及了解症状、体征外有特殊性。过去常应用系谱分析，染色体及性染色色质检验作为遗传病诊断的主要依据，再辅以相关的酶学分析从而作出诊断。随着分子生物不的迅速发展及其在遗传性病诊断中的广泛应用，基因诊断技术诞生，基因诊断技术为遗传病的临床诊断起了很大的促进作用。聚合酶链反应（PCR）技术是基因诊断主要技术之一。这种快速、灵敏的基因体外扩增技术与多种分子生物学手段相配合可以检出大部分已知的基因突变、基因缺失、染色体错位等，PCR技术日益成为遗传病诊断的最有效、最可靠的方法之一。以下举几个在国内有普遍意义的例子。
（一）、PCR检测地中海贫血；地中海贫血（Thalassemia）是一种遗传性慢性溶血性贫血病，是世界上最常见且发病北最高的一种单基因遗传病。在两广、贵州、四川等地发病率较高，在广西等地高达15%。地中海贫血是由于基因突变造成珠蛋白的不平衡，使结构正常的肽链合成量减少甚至没有合成表现为溶血性贫血。接受累基因种类分为α、β、γ等，其中以 α、β地贫为最常见，危害了最大。珠蛋白基因簇位于人6号染色短臂上，有两个重复基因基因位于α1、α2、两个α基因及其旁侧序列有很大的同源性，易出现染色体不等交换，导致α基因缺失－α地贫。α地贫基因部分缺失有α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1及α2基因同时缺失及非缺失型地贫。可以应用PCR技术扩增α1、α2基因从而检测这些基因是否缺失、突变等，从而对α型地中海贫血作出诊断。β地中海贫血基因缺陷主要表现为基因序列中单一核苷酸的突变，或少数碱基的缺失、插入，使正常β珠蛋白肽链合成减注或缺失。应用位点特异性寡核苷探针（Aso）进行PCR产物斑点杂交即可对其作出诊断。
（二）、苯丙酮尿症，苯西酮尿证（PKU）是一种常染色体隐性遗传病，患者因苯丙酸羟化酶转化为酷氨酸，使苯氨酸及其代谢物在体内大量蓄积，出现脑组损伤及不可逆性智力发育障碍。PKU患者出生时正常，新生儿一经确诊为PKU停止母乳喂养采用低苯丙氨酸钦食疗法8—10年，可使患者智力水平发展维持正常。由于低苯丙氨酸钦食非常昂贵，一般家庭难以承受，因此，施行产前诊断，防止患儿出生是最好的选择。PAH只在肝细胞中表达，不能用血细胞，成纤维细胞、羊水、绒毛细胞进行酶活性分析，只能进行基因诊断。PKU的基因变化并非全部PAH基因的缺失，而是以点突变为主要表现形式，而且其突变位点很多。必须使用PCR扩增结合，ASO，SSCP或使用扩增片段长度多态性分析（AmpFLA）进行检测，这些技术都较复杂，检验人员须经专业培训。
（三）、血友病，血友病是一组最为常见的遗传性凝血障碍，根据因子缺陷的不同分为甲、乙两型，（Ⅷ、Ⅸ因子缺陷），也有复合型血友病，但不常见。甲型血友病发病率为1/10000，Ⅷ因子基因位于G6PD基因附近，全长186Kb，大范围的基因重排（缺失、插入、重复）导致甲型血友病的病例很少，仅为Ⅷ因子缺陷的5%，大部分病人表现为单个或少数碱基的突变。由于Ⅷ因子基因长度为186Kb，突变位点多，而且新生突变频率高，从临床角度讲不能对每一个突变都检测，可对最为常见的几种突变类型进行检测，主要的检测手段是PCR结合RELP分析。乙型血友病发病率占血友病的20%，其基因变化及检测方法与甲型血友病类似。
（四）、性别发育异常，区别雄性及雌性的物质基础是性染色体，哺乳动物胚胎发育中，雌性表型不需要任何调节，而雄性表型则由多因素决定，位于Y染色体上的指导雄性性别分ss化的基因命名为睾丸决定因子（TDF）。现代研究表明，SRY（Sex-determining region of Y chromosome）基因是TDF基因，位于Y染以体短臂末端。SRY区缺失易导致46XY核型个体发育成女性。进行基因检测可以检出SRY基因组的易位及缺失，从而诊断性别发育异常，这一探索性别异常的研究非常热门。另外还有一种46XY核型异常的病人即睾丸女性化，这是用于雄激素受体（androgen receptor,AR）基因缺欠，使雄激素的靶基因对雄激素不应答就答或不全而引起的，根据病情的不同有不同的表型，AR缺陷有很高的新生突变频率，表现为无家族史的散发病。AR基因长90Kb，位于X染色体上，AR基因异常大部分为个别基因碱基的突变，可以通过PCR结合ASO或SSCP检出。
（五）、脆—X综合征，脆—X综合片（fragile-X Syndrome,Frax）是发病率最高的一种X-连锁的智力低下综合征（X-linked mental retardation XLMR）。因这种综合征与X染色体上的脆位点连锁而得名。大多数FRAX男性智商（IQ）低于50，并有随着年龄增长而下降的趋势。用人工酵母染色体（artificial yeast chromosome,YAC）克隆技术分离获得覆盖X-脆位点区域的YAC克隆，在这一克隆中获得一个能在人脑中表达的基因命名为FMR-1（fragile X mentai retardation-1）,FMR-1的5‘端有一个CGG（精）三核苷酸串（CGG）n,正常人群中（CGG）n中存在多态性，重复序列为6-46个，当重复超过52个时，此区域的分裂呈不稳定，导致重复序列大幅度增加，无临床表现的携带者插入片段长度小于500bg，有临床表现者，长度都大于600BP而且伴有甲基化。人们将500bp作为前突变与全突变的分界线。对Frax的诊断以前用细胞遗传学的方法检测脆位点，实验条件严格，成功率不高。现在采用分子遗传学方法即可诊出前突变及全突变。用PCR扩增CGG重复序列，检测扩增产物的长度。突变基因的扩增片段增大，体细胞异质性时出现多条长度不等的扩增带甚至拖尾成一片，或者因为扩充的全突变插入片段过长超出PCR扩增能力而结果无扩增现象。
2、PCR基因扩增法在“Torsch”诊断中的应用，在妊娠早期（1-3个月），有些病原微生物的感染易导致胎儿畸形，这些病原体中最常见的有弓体（TOX）、风疹病毒（RV）、单纯疱疹病毒（HSV）、沙眼衣原体（CT）、及巨细胞（HCMV），对这几种病原体的检测根据其英文词首简称为Torsch试验。
（一）、弓形体的PCR检测，弓形体有广泛的自然疫原性，人体多为隐性感染，抵抗力低时可以有临床表现。弓形体的诊断较困难，血清学方法敏感性较高但有交叉性出现假阳性而且无法确定近期感染、远期感染或一过性感染。确诊的方法是活组织检查或动物接各，这些方法阳性率太低不能推广。PCR检测可以检出样本中1-2个病原体而且准确性高，是目前对弓形体检测最优秀的方法。作为优生优育检查应于妊娠前或妊娠早期取全血样本，可以用EDTA或肝素抗凝，以EDTA抗凝效果最好，检测外周血白细胞中是否有TOX存在。对于不孕，多次自然流产或养小动物的产期妇女，作弓形虫检测有更重要的临床意义。
（二）、风疹病毒感染：风疹病毒（RV）是一种单股正极性RNA病毒，人是风诊病毒的唯一宿主。RV感染可以引起胎儿的畸形，影响胎儿免疫系统的发育，因此RV检测在优生优育工作中显得非常重要。RV检测可以用直接培养法及IgM抗体测试法。培养法费时很长而且常受到其它病毒的干扰，IgM测定法结果了不太准确，PCR法敏感性及特异性都很高而且简便快速，是RV感染最优秀的测试方法之一。风疹病毒侵入体内后在上呼吸道增殖而出现症状，面部出现丘疹，迅速遍及全身。样本采用妊娠母亲的咽部拭子、血清、产妇的绒毛或妊娠如羊水等。RV病毒是RNA病毒，PCR扩增较复杂，应注意样本的采集时机，操作的准确性。
（三）、单纯疱诊病毒，单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）是一种DNA病毒，可引起多器官的炎症，可通过性接触传播。HSVⅡ感染复发率高，80%的感染者于12个月内复发。HSV感染后经机体免疫系统清除，少数病人终生携带，体弱时复发。PCR法检测HSV敏感性高而且可以直接对HSVⅠ/Ⅱ型进行分型鉴定。
（四）、沙眼衣原体，沙眼衣原体（CT）不仅能引起沙眼而且能引起生死器感染，是一种性传播性疾病。与淋病（NG），梅毒等经典性传播性疾病不同，CT易经其它接触途径传播，少数地区对妊娠期妇女普查结果表明此人群中发病率高达20%-30%。在欧美等国家CT的感染已超过淋病而居性传播性疾病之首。衣原体感染常呈无症性或非特异性症状的隐性感染，不容易诊断。以往用培养法进行确诊，费时且敏感性、准确性都不足。PCR用于CT检测时应注意不同检测目的的取材不同，对于性传播性疾病诊断应取生殖道分泌物（查脱落细胞），而对于早期妊娠病人应查其全血样本，在妊娠后期或临产时再查阴道分泌物以便指导生育时产道清理。
（五）、人巨细胞（HCMV），HCMV感染十分普遍，除少数原发性感染发生原发性单核细胞增多症外，极大多数为隐性感染。HCMV可以长期潜伏在体内，当机体免疫功能低下时，病毒会激活而造成严重疾病在妊娠期如果孕妇感染HCMV可以引起早产、畸形、死胎及新生儿巨细胞包涵体病等。HCMV属疱疹病毒科，可以从唾液、尿、宫颈分泌物及乳汁排出。HCMV“金标准”的诊断试验是用单层成纤维细胞作病毒培养，其它的实验检查有血清学的检测及包涵体检测。PCR是HCMV检测的一种新方法，用于检测的样本有血，生殖道分泌物拭子等，用于优生优育检测时应取血样本。对于早期妊娠病人若有HCMV感染应再检测羊水，或其它妊娠物，对病人认真及进跟踪检查，综合判断并采取相应的医疗措施。
PCR应用于优生优育有很大的优越性，使这一技术的推广应用刚刚起步，应注意操作的准确性，尽量避免误诊。对感染性疾病首先应取孕妇血样检测，有可疑时或血中检出病原体核酸时应尽早作羊水等妊娠物检查。不管是否怀疑胎儿有严重遗传病倾和中或有感染引起的畸形风险，对胎儿的去留应尊重胎儿父母亲的意见。
5、实时荧光定量PCR技术在研究方面的部分应用
一、 新药开发研究，人用药物及其他药物
针对一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、细菌病等，在新药的开发过程中，快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金，与以前所用的Elisa等方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量，因此有利用分析药物的作用效果，为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。
此方法除了用于人用药物以外，还可以用于畜用药物，甚至其他经济动物及植物的药物研究等，因此其在药物研究方面的应用范围是很广的。
二、 超早期感染用药物及疗法的研究与开发
实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人体内产生抗体，同时，由于其灵敏度与Elisa相比不可同日而语，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定。因此就出现了一个新的领域，即在病毒或细菌含量很低时如何用药，用什么药以及用药量等进行研究，为将疾病消灭在超早期作出贡献。
三、 药物疗效研究，人用药物及其他药物
对于一些已经上市的新药或是应用了很长时间的老药，其用药的效果以及用药量及用药时间都可以进行进一步的研究，为更加合理化的应用这些药物为人类造福进行进一步的研究。以前所用的方法由于不能准确定量，灵敏度也不够，因此有很多需要研究的内容没有完成。这一方面需要研究内容很多，意义也很大。
四、 新的愈后指标的研究
对于感染性疾病，在药物作用至一定程度后，就认为可以停药了，但是应该在什么停药，现在大都没有一个明确的指标，现在所用的指标由于受到检测方法的灵敏度及准确性限制，这一指标未必合理，因此有必要对治愈的指标以及指标与复发率以及疾病转化为其他疾病之间的关系等进行进一步的研究，从而为药物或疗法彻底治愈疾病打下坚实的理论基础。
五、 新诊断及检验试剂的开发
现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa法等等，而荧光定量PCR方法以则可以做到这一点，从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂，从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等；这类试剂的种类是非常多的，所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。
六、 血液检验漏检率
由于实时荧光定量PCR方法比Elisa灵敏很多，因此，血站或血液研究所一般用来研究Elisa方法的漏检率，即分析Elisa方法测定为阴性的血样，再用实时荧光定量PCR方法来复检。复检时，一般24个Elisa阴性的血样混合成一个样本进行检测。上海用此方法在用于血液制品的血液中发现一例HIV，后经测定供血者，证实病人的确是HIV阳性。北京市红十字血液中心正在测定北京血站中5万份Elisa阴性血样的漏检率。由于不同地区所用的Elisa试剂、方法、批号等都不相同，因此不同地区都有必要进行这一工作。
由于荧光定量PCR方法的快速、灵敏、定量的特点，其在研究及开发方面的应用是不胜枚举的，如研究个人基因型与药物疗效之间的关系等；研究人员也可以根据自己研究项目开发其新的用途。
二、TL988实时荧光定量PCR检测系统产品介绍
1、如何选择一款适合自己的PCR仪
回顾分子生物学的发展历程，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。我公司从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术，为定量PCR仪的选择提供详细参考。
定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。从前面的原理介绍不难看出选择定量PCR仪的关键--由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势--仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽；多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管，前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。--随着定量PCR技术在临床诊断、疾病

上面已经很详细了

---

修武县18694892414： 哪位能介绍一下PCR反应体系啊?请大家介绍一些生物方面的论坛？
雷辰卫复： 这方面的知识可以到生物帮上那里了解啊,那拥有覆盖所有实验领域的精品技术文件,图文并茂的提供生物领域的学科知识、实验技术方法与技巧等,那里会有介绍. 标准的PCR反应体系: 10*扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物...

修武县18694892414： 请问有谁可以提供高中生物关于pcr技术的知识点,还没学但是遇到了这方面的题目,希望能详细一点,谢谢 - ？
雷辰卫复： 生物选修三的内容聚合酶链式反应(PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的生化技术,反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP等.反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板,故DNA数以指数方式扩增.

修武县18694892414： 请教于各位呼吸内科老师,关于痰涂片、痰培养及PCR的区别 - ？
雷辰卫复： PCR只是检测结核杆菌的DNA存在与否,即患者体内是否存在结核杆菌.至于检测结核杆菌的耐药性好像不行.而痰培养可以培养出结核杆菌,与此同时可以进行药物敏感试验(药敏试验),以检测结核杆菌的耐药性.另外结核杆菌的培养时间较一般细菌长.

修武县18694892414： 如何查找白色念珠菌SOD2基因的碱基序列,我想根据它的序列来设计PCR引物的,哪位老师同学帮助一下~~谢谢 - ？
雷辰卫复： 直接到NCBI中输入这个基因的名字,然后根据物种来源选择,就可以找到了

修武县18694892414： 大连拍艺术照又好又便宜的有没有?适合学生的？
雷辰卫复： 天健论坛(www.runsky.com),有个婚庆板块叫“我形我秀”(好像)上面好多有特色的工作室,肯定都比影楼好而且还便宜. 比如三丰视觉,F2,射手座等等,他们还都有样片展示,你可以看看你喜欢哪家的风格.

修武县18694892414： ...但是通过老师和同学的帮助下以及自己的努力 已经取得很大的进步 并争取在期末考试取得好成绩,请父母放心 这段话谁能用英语给我翻译一下吖 哪怕一两... - ？
雷辰卫复：[答案] MY english marks are not satisfied ,but through the help with my teacher and classmates as well as my hardwork