T载体克隆的实验原理

T载体克隆的实验准备~

清洗，5个100ml锥形瓶，1个50ml锥形瓶，6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒准备100ml超纯水溶液:LB300ml(液体50ml+50ml，固体100ml)，0.1mol/L CaCl2 10ml， 100mg/mlAmp 1 ml，20mg/mlX-gal 1 ml， 200mg/ml IPTG 1 ml。大肠杆菌菌液1ml 感受态细胞 连接产物 4管 4 x 5 = 20ul 做4份 目的基因 T载体 T4连接酶 10x冲液 4 x 4uL 4x1uL 4x0.5uL 4x1uL 灭菌：5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒，10ml超纯水，LB培养基，1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具2副，，0.1mol/L CaCl2

肯定是开环，不然怎么连接。连接的原理就是试剂盒中的载体pmd19-t是已经经过内切酶ecorv反应了的，并且在露出t的一端继续添加几个t，而我们的pcr反应中，在聚合酶的作用下，会在一端添加a，这样它们在反应中就很快连接成功。

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。
一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。

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双桥区14790288932： TA克隆的具体原理是什么? - ？
敛试贝西：[答案] TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法.因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性,通常在3加上A.例如:Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,PCR反应时在每条PCR扩增产...

双桥区14790288932： T载体的作用是什么?克隆时为什么要用T载体? - ？
敛试贝西： 我做过几个克隆,没用过T载体,直接将酶切后纯化的产物进行连接,照样可以连接成功,基本上都会有10-50个克隆长出来.我用的是Sal I和Nde I这两个酶切位点,似乎这两个都是平端的哦.

双桥区14790288932： 什么是T载体 - ？
敛试贝西： 通过克隆甘露聚糖酶基因到pMD-18T载体构建了质粒pMD-18Tman2XcmI,克隆的甘露聚糖酶基因两侧各引进了一个特定的XcmI 酶切位点;用XcmI酶切质粒pMD-18Tman2XcmI可以制备T载体.因为甘露聚糖酶基因作为填充片段和筛选标记受半乳...

双桥区14790288932： 含粘性末端的目的片段能与T载体相连吗 - ？
敛试贝西： T克隆的原理是基于常规PCR反应中所使用Taq聚合酶能够在PCR产物的3'末端非特异性添加一个A,这样实际上常规PCR产物都含有3端突出一个A的粘性末端.基于这个原理,常规的线性T-克隆载体(PUC18和PUC19等)在其3'末端添加一个T,这样的载体能够和任何PCR产物进行连接克隆,并不需要添加任何特异性的粘性末端位点.这个就是T克隆的原理了. 分析原因可能有: 1、T载体连接有问题,重新调整目的片段和T载体的比例,重新连接. 2、PCR某种试剂出问题了,以前有个师姐就是这样,怎么也扩不出来,让别人带样扩出来了,原来是Taq 酶出问题了,你也可以确定一下.

双桥区14790288932： T载体指什么? - ？
敛试贝西： 应该是分子克隆用的载体,使用前是双链线性片段,上面有必要的测序或表达元件,两头是黏末端,各在3'有一个游离的T(故名T载体).因为PCR实验中用的聚合酶大部分都是taq和taq的同类酶,会在PCR产物的3'末端自动加一个A,这样PCR产物纯化之后无需酶切就可以与T载体连接,连接结果为带有目的片段的环状质粒载体.之后转化挑克隆,进行表达和测序.

双桥区14790288932： T载体是什么? - ？
敛试贝西： 一段线性双链DNA载体,载体的两端3'末端各有一个额外的T.因为大部分Taq聚合酶会在PCR产物3'末端添加一个额外的A,所以使用T载体可以比较方便且高效(相对于平末端)进行PCR产物的连接反应,以方便克隆的构建或检测.

双桥区14790288932： 链接载体和粘性片段时 片段量过多有什么影响 - ？
敛试贝西： 关键是这个粘性末端带的是什么.因为t 载体的末端是突出的t.如果直接是pcr产物,需要考虑,用taq酶扩增的片段可以直接连,如果是高保真酶扩增的片段,需要用taq酶加a尾,大约30min左右. 如果是已经经过酶切的片段,确实要补平加a.如果是这样,为什么不直接去连目标载体呢?

双桥区14790288932： ta克隆的优缺点 - ？
敛试贝西： 一、缺点: 1、PCR产物的酶切和判断比较困难. 2、另外酶切连接过程本身也相当地费时费力. 二、优点: 1、克隆PCR产物较简便、快捷的方法. 2、不需使用含限制酶序列的引物,不需将 PCR 产物进行优化,不需把PCR产物做平端处理...

双桥区14790288932： extaq扩增的产物可以做t载体连接吗 - ？
敛试贝西： T克隆原理基于规PCR反应所使用Taq聚合酶能够PCR产物3'末端非特异性添加A,实际规PCR产物都含3端突A粘性末端.基于原理,规线性T-克隆载体(PUC18PUC19等)其3'末端添加T,载体能够任何PCR产物进行连接克隆,并需要添加任何特异性粘性末端位点.T克隆原理.析原能: 1、T载体连接问题重新调整目片段T载体比例重新连接 2、PCR某种试剂问题前师姐扩让别带扩原Taq 酶问题确定

双桥区14790288932： 如何提高PCR产物克隆的效率 - ？
敛试贝西： 【TA 克隆的优缺点】1、优点:(1)是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法.(2)不需使用含限制酶序列的引物,不需将 PCR 产物进行优化,不需把 PCR 产物做平端处理,不需在 PCR 扩增产物上加接头,即可直接进行克隆.(3)TA克隆选...