逆转录PCRPCR各步骤的目的
逆转录PCR和PCR各步骤有着明确的目的，以确保高效和精确的扩增过程。
首先，预变性是关键步骤，通过高温破坏DNA的二级结构，增强模板的可扩增性。它有助于引物与模板的结合，尤其对于基因组DNA，充分变性是必要的。在使用热启动Taq酶的反应中，预变性还激活了酶的活性，促进PCR反应的进行。
PCR的三个循环主要包括：模板DNA的变性，通过加热至93℃使双链DNA解离为单链，为引物结合创造条件；模板DNA与引物的退火，将温度降至55℃，引物与单链DNA的互补序列配对；然后是引物的延伸，TaqDNA聚合酶以dNTP为原料，按照碱基配对原则，复制出一条新链，形成半保留复制。
延伸时间的选择是根据目标DNA片段长度决定的。短片段通常只需1分钟，长片段则需要更长。最后一轮通常延长至4-10分钟，以确保完全扩增并便于后续的TA克隆。此外，延长的10分钟还有助于添加A尾，便于后续的克隆应用。
PCR引物的选择需谨慎，要避免形成同源多聚体、二级结构和自我互补。计算熔解温度，确保正反向引物的GC含量相似，目标片段的GC含量应在40%-60%之间。引物长度和位置需调整，3'末端应为G或C，且避免引物间的互补性。一条引物不应有连续三个互补核苷酸。
在实际操作中，变性温度应根据模板的C+G含量确定，复性温度需控制在适中，避免非特异性结合。PCR循环次数取决于模板拷贝数和效率，理想的扩增产物应是特异性的，非特异性产物应非常低。例如，在TaqDNA聚合酶条件下，30个循环后，如果起始拷贝数为10的5次方，通常可以得到理想的结果。
扩展资料
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
逆转录PCR和实时PCR
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA...
简述至少3种由PCR技术衍生出来的技术及其应用?
【答案】：①逆转录PCR技术，将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术，是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法；②原位PCR技术，将PCR技术与原位杂交技术相结合，在甲醛固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性...
RT-PCR,QRT-PCR,real-timePCR之间什么区别
PCR：一种快速的DNA复制方法,由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成。RT-PCR：反转录PCR(reverse transcription-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA（cDNA），再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。QRT-PCR在RT-PCR体系中同时加入内参...
pcr中三个英文字母分别是什么意思简述pcr的组分步骤
PCR这个缩写的全称形式是 polymerase chain reaction,含义是:聚合酶连锁反应。pcr技术原理及步骤如下 1. 反向PCR技术 反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法。主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA.后酶切片段自身环化。以环化 2. 锚定PCR技术 用酶法在一通用引物反转录。
PCR的原理是什么 的原理是什么,它有什么用途
用途：1、核酸的基础研究：基因组克隆 2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序 3、反向PCR测定未知DNA区域 4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控 6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达 8、医学应用：检测细菌...
RT-PCR的原理是什么?有何用途?
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段...
逆转录原理
逆转录PCR （ RT-PCR ）的原理 逆转录PCR (RT-PCR )具有较高的灵敏性、操作简单等优点，常用于基因定量分析、生物学检测等，此外常用逆转录PCR克隆目的基因。 本文主要讲述了逆转录PCR的原理、重要参数以及操作注意事项。cDNA的合成是RT-PCR 的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物...
关于PCR,你知道多少?(四) ---几种特殊的PCR
1、锚定***PCR***（anchored PCR）通常采用的PCR反应必须知道欲扩增的DNA或RNA片段两侧的序列，而在大多数情况下对某些序列本身或其旁侧序列并不清楚，“锚定PCR”可以帮助克服序列未知或序列完全未知带来的障碍。基本做法是：分离细胞总RNA或者mRNA，在反转录酶的作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDN...
PCR过程 cdna转录成mrna步骤
先合成原始转录产物，然后转录产物的后加工。转录中，一个基因会被读取并复制为mRNA。就是说，以特定的DNA片段作为模板，以DNA依赖的RNA聚合酶作为催化剂，合成前体mRNA。
PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR的区别与联系
1、所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reverse transcription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也简称RT-PCR，但是这是不对的，不推荐。基本操作过程是将所提取的RNA进行...
苍董急支： 一步法操作简便,而且可以降低反应的污染风险,价格相对来说也贵一点,BIOG的一步法荧光定量PCR试剂我们实验室用过,实验效果的确还不错,特别方便.
瓜州县15756048719： 逆转录PCR有什么作用 - ？
苍董急支： 主要检测mRNA的表达水平,通过逆转录可以得到我们想要的目的基因,为下一步研究做准备.
瓜州县15756048719： 反转录PCR的目的我是做转基因的转出来后老板让我做反转录PCR做那个干啥啊?我想问下 对我试验有什么意义呢? - ？
苍董急支：[答案] 通过反转录PCR,验证你转进去的基因有没有表达. 也就是RT-PCR可以验证转基因的XX(你研究的东西)中,这个转基因有没有起作用,用没有其功效
瓜州县15756048719： RT - PCR的原理是什么?有何用途? - ？
苍董急支： RT-PCR有两种解释:1,最常用的理解:RT 是'逆转录'(reverse transcription)的缩写2,现在也有人这么用:RT是'实时'(real time)的缩写1,先说逆转录PCR:这项技术使用的'逆转录酶'来自逆转录病毒,是一种能按照碱基互补配对原则...
瓜州县15756048719： RT - PCR原理及操作 - ？
苍董急支： 原理:RT-PCR 为反转录RCR(reverse transcription PCR)和实时PCR(real time PCR)共同的缩写.逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条...
瓜州县15756048719： 逆转录PCR的介绍 - ？
苍董急支： 逆转录PCR(reverse transcription PCR)或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增.
瓜州县15756048719： pcr技术扩增 - ？
苍董急支： PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95度时解旋,55度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至72度左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链.由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能...
瓜州县15756048719： 荧光定量pcr和实时荧光定量pcr还有反转录pcr都是什么呀?有什么区别,分别是什么作用啊? - ？
苍董急支：[答案] 实时就是指每个阶段的荧光都有收集,其实现在所有的荧光定量PCR仪器都是实时的.荧光定量PCR的英文简写是:FQ-PCR,F是荧光的缩写,Q是定量的缩写.(或者写成是RT-PCR.RT就是realtime的缩写). 做定量PCR的目的是为了了解起始模板数...
瓜州县15756048719： 构建过量表达载体时为什么要用反转录pcr获取目的基因 - ？
苍董急支： 反转录pcr获得的目的基因的优点是没有内含子~过量表达载体要用尽量精简的目的基因构建而且为了目的基因表达效率够高,能够缩短序列长度.
瓜州县15756048719： 反转录PCR和荧光定量PCR - ？
苍董急支： 一个是RT-pcr,reverse transcription pcr的简写 一个是real-time,一般不会简化为“rt-pcr”,又称实时定量pcr,Q-pcr,应该就是你说得荧光定量 而你要测mRNA的量,就是先反转录成cDNA,再作定量pcr,就是前两者的合,常称为qRT-PCR 有很多real-time的试剂盒,你可以网上看下说明书
