定量PCR是不是一定要以cDNA作模板,可不可以直接拿总DNA作模板直接做定量?
如果你本来提取的是mRNA或者Total RNA，那不论哪家出的RT试剂盒所得到的cDNA都可以作为实时荧光定量PCR反映中的DNA模板用。
前提是RNA的质量要有保证。纯度是一个因素，260/280的比值至少要大于1.8。还有就是最好先把RNA跑一个胶看看，如果是提取的Total RNA，应该能看到2条明亮的条带（rRNA)，中间没有拖带。说明没有降解。
在实时荧光PCR中。模板的定量有2种方法：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数；
相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化.
如果你做的是DNA的定量，可以用DNA 模板。你用质粒作为标准品做标准曲线，最后可以换算出来拷贝数，这是绝对定量。
如果是做转录，表达量的变化，需要提取RNA，反转录为cDNA，然后再做相对定量。
实时定量PCR,一定要做标准曲线么
绝对定量肯定要做标准曲线。不做标准曲线，你如何定一个“绝对”的量？或者如果你有一个参照样品，你可以做相对定量，也就不一定要做标准曲线了。其实相对定量做标准曲线也是不错的，可以矫正扩增效率。
PCR产物琼脂糖凝胶电泳产物是只要有就在紫外灯下可见,还是要积累到一定...
积累到一定量，这是肯定要的。PCR本身就是为了批量生产某一段目的基因或DNA序列。很难想象拿着0.1ng\/ul（打个比方）的DNA跑胶还能看得见什么条带。 我觉得用什么染料都要求积累。
为什么PCR扩增是在有一定数量范围的基因型内而不是确定的数量_百度知 ...
我不知道看的关于什么的文章，我觉得他是用29对引物在不同的基因型中pcr特异的序列，但是不是29对引物都能拉出特异的序列（即29个片段），只能拉出有限的2到8个不同的片段，从而体现了不同基因型的差异性
一文知晓PCR,定量PCR,数字PCR方法选择
这也表明了传统PCR平台期测量时结果存在变异，产出的DNA量不一定能反映最初情况，所以无法进行定量。荧光定量 PCR 同样在图3中，发现在指数期内，3个反应孔的扩增曲线完全重合，说明指数期内进行检测将更加精确，可实现更加准确的定量。阈值线是扩增产物荧光强度超过背景时的一个荧光强度值，样品达到此荧光...
荧光定量PCR一定要用管家基因么?
管家基因是用来做对照的，它表达量恒定，这样你可以通过比较它和你的基因，做出标准化的数值，所有定量必须带有管家基因才能排除干扰。
什么是原位、梯度、定量、普通PCR?
定量PCR 指估算样本中的原始摸板数。它是通过一定循环次数的PCR的扩增后，PCR产物量来判断品质的原始摸板数。原理是：定量PCR是以PCR扩增为基础的，而PCR扩增是有规律可循的。定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。如果用No代表PCR反应中的原始模块数，N为扩增次数，那么扩增产物的初期直线增长：而经过...
荧光定量PCR(一)— 基础介绍
由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异，因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择（探针法可连接我们的荧光定量PCR试剂盒的编号及对应的机器型号）由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针...
荧光定量pcr原理
荧光定量PCR原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制...
什么是PCR?
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH...
什么是PCR技术PCR的基本原理是什么
PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，...
权邵小儿：定量PCR的模版既可以使总DNA,也可以是cDNA,但两种做法的用途不同.如果用总DNA做模版,你检测的就是总DNA的拷贝数.如果以cDNA为模版,你检测的就是某个基因的表达水平.
铜陵县15348232595： 弱问:做实施定量PCR一定要提RNA来逆转录再做吗?为什么不能直接提DNA做? - ？
权邵小儿：[答案] 看你要做什么了.做基因转录,那只有做cDNA,向楼上说的那样. 如果是做染色体定量,那就是用DNA.比如常见的DNA病毒定量,直接提DNA来做.不过RNA病毒定量就要用cDNA了
铜陵县15348232595： 请教做定量PCR用DNA做还是RNA做 - ？
权邵小儿： 都可以.如果要检测DNA浓度,就用DNA做模板;如果要检测基因表达水平的RNA浓度,就用RNA的反转产物cDNA做模板.
铜陵县15348232595： 检测胞内DNA病毒,用到荧光定量的时候,模板用病毒DNA ,还是病毒的cDNA?谢谢了 - ？
权邵小儿： 理论上的差别不大.不过要点是你要知道模板的定量.实际上在实验的过程中,还要考虑到PCR条件,比如DNA结构,是否有特殊的序列影响PCR效率等等(比如病毒DNA中,在PCR目标附近的序列,cDNA上就没有),所以用病毒DNA是最好的.
铜陵县15348232595： 荧光定量PCR引物为什么要跨内含子设计?？
权邵小儿： 避免基因组DNA的影响. 荧光定量PCR的扩增区段比较小,也就200bp左右,而且一般以cDNA为模板.如果不注意引物设计的话,很可能落在同一个外显子内.此时,无论cDNA还是基因组DNA都会给出同样的信号,也就是说定量会出现误差.如果引物跨内含子,则cDNA会给出信号,而基因组DNA由于引物无法完全配对而没有信号,也就避免了基因组DNA的影响.
铜陵县15348232595： 为什么荧光定量pcr可以准确定量 - ？
权邵小儿： 为什么荧光定量pcr可以准确定量 实时定量的引物设计要求比较高,可以按普通引物设计的方法来做,但是设计时要注意扩增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之间.同时要保证这对引物有绝对的特异性,因为要是产生非特异性扩增的话,就不能准确的计量模板量了,这样就失去了实时定量的意义了 用已知浓度的DNA样本(通常是质粒)梯度稀释成一系列的样本.做实验的时候,这些标准品和待测样本加在同样一块96孔盘的不同孔内.一起做PCR. 标准品的荧光强度和已知的浓度作图,可以得到一条标准曲线.而待测样本的荧光强度测出以后,就可以在标准曲线上算出样本浓度了.
铜陵县15348232595： 经过pcr扩增之后,为什么就能证明基因的表达量的多少 - ？
权邵小儿： 基因表达水平一般是通过该基因转录的mRNA的多少来衡量的,PCR之后可以通过产量的多寡来判断.但是普通PCR一般只能定性判断基因表达量,实时荧光定量PCR可以通过PCR扩增来定量计算RNA含量(通过比较内参的ct值).所以,传统曲线只能定性判断,实时荧光定量PCR曲线可以定性判断.
铜陵县15348232595： 实时定量pcr只能用于rna吗 - ？
权邵小儿： 楼主是说荧光定量PCR吗?一般常用于mRNA的水平检测.其实有时候也可以用于DNA的,比如你的转基因品系相对野生型里面有多拷贝的基因,也可以通过RT-PCR来筛选这种转基因品系.
铜陵县15348232595： 荧光定量PCR为什么先提RNA - ？
权邵小儿： 荧光定量RCR和普通PCR一样,都以双链DNA为模板.如果用作基因表达分析,即检测mRNA水平的基因表达,需要先提取总RNA,反转录成双链cDNA后再做real-time PCR检测.
铜陵县15348232595： 荧光定量PCR引物为什么要跨内含子设计? - ？
权邵小儿： 荧光定量PCR的扩增区段比较小,也就200bp左右,而且一般以cDNA为模板.如果不注意引物设计的话,很可能落在同一个外显子内.此时,无论cDNA还是基因组DNA都会给出同样的信号,...
