mix酶和高保真酶
作者&投稿：刘步 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
邰琪15358803733问： 做普通PCR选择什么试剂盒比较好？
安居区小儿回答： 你的片段是多大,如果低于一个KB的话,没有必要用高保真的酶,最普通的taq就可以用.如果你非要用,NEB有个高保真的2X Fhusion MIX那个非常不错,我用过效果很好的.也是用他克隆出来基因做酶切的.我的影响中似乎Fermentas的试剂盒里面有阳性对照样品和引物把.我建议你在做PCR时使用一个新的试剂盒,最好能一边跑阳性对照,确定你的酶是没有问题的,有的时候在运输的过程中,酶有可能失效.此外,你最应该确定的还是你的引物没有问题,可以扩增出基因来.PCR事实上应该是最容易干的事情的.……………………详细资料请参考:突变试剂盒: http://product.bio1000.com/103242/
邰琪15358803733问： 怎么看荧光定量PCR的试剂盒好不好 - ？
安居区小儿回答： 如果你想做荧光定量PCR的根据实验思路来说应该需要一下试剂和仪器1.模板提取(一般为RNA):Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理水2.模板浓度测定:分光光度计或NanoDrop3.逆转录:逆转录试剂盒(或者一步法试剂盒),这一步可以用普通PCR做,也可以用水域做.4.荧光定量PCR试剂:通常有用SYBR Green Mix做的,但是这里建议你用EvaGreen做,灵敏度和平行性都要好于SYBR Green,并且如果你那是ABI或者Stratagene的PCR如果用SYBR Green还需要加一步Rox很麻烦.5.其他:除了以上的那些还需要离心管、PCR管或板(Axygen反应比较好)、移液枪等,暂时就想到这么多.
邰琪15358803733问： 如果扩增一个2000 bp的DNA片段.pcr的反应体系是什么? - ？
安居区小儿回答： 这个反应体系一般根据你的mix性能,引物Tm值,以及扩增的片段长度而定.光看基因长度不行吗,因为我不知道你用的酶的扩增效率.
邰琪15358803733问： 高保真酶的PCR结果？
安居区小儿回答： EX-TAQ很容易出现杂带的,这个酶本身的BUFFER是高离子浓度.你可以试试用EXTAQ酶扩出条带后,在琼脂糖胶上切下纯化在用高保真酶扩一下,扩出来就是有产物扩不出就是非特异扩增
邰琪15358803733问： 请问PCR中高保真酶、T - easy载体分别是啥玩意儿啊?谢谢大家! - ？
安居区小儿回答： 高保真酶就是3'->5'的外切酶活性比较强,一旦出现错配,可以及时切除出错碱基并重继续扩增.T-easy载体,应该是做TA克隆使用的载体,线性双链DNA的3'末端多一个T,以便和普通Taq扩增的PCR片段(末端多个A)直接高效率连接
邰琪15358803733问： 我们实验室要进一批2*Pfu PCR MasterMix ?不知都选择哪家的好? - ？
安居区小儿回答： 博凌科为的2*Pfu PCR MasterMix 实验效果挺好的 ■ 显著提高PCR 反应的特异性和灵敏度,还能有效扩增GC 含量高、二级结构等复杂模板.最低可扩增2 个拷贝的目的模板,使实验结果更加精确.■ 独创的Taq Plus MasterMix 配方使整个反应...
邰琪15358803733问： PCR SuperMix中的Taq酶和Pfu酶有什么区别?它们分别有什么作用? - ？
安居区小儿回答：[答案] 两者都是DNA聚合酶,区别在于,pfu是高保真DNA聚合酶,即DNA合成时碱基错配率比taq酶低,一般情况,不太长的片段或序列准确度要求不是很严格的用taq酶,对于长片段或序列准确度要求高的用pfu酶.在实际使用中,往往鉴于pfu酶...
邰琪15358803733问： 高保真酶pcr基因片段时,不同錺cr出不同长度,是什么原因 - ？
安居区小儿回答： 常见的高保真酶有Pfu,Pfu Ultra,但是我用过最好用的高保真酶是Phusion.因为一般的高保真酶因为有外切酶的活性,虽然提高了保真度,但是扩增效率会降低,所以用Pfu的时候,往往需要扩增时间要比Taq酶长,Pfu Ultra好一些.但是都难免会碰到Taq酶P有条带,换成高保真酶,直接P可能没有结果,或者是条带很弱.Phusion最牛,保真度可能大概有Taq酶的50来倍,而且太强劲了,基本没有P不出来过.
邰琪15358803733问： 在PCR扩增实验中应注意什么? - ？
安居区小儿回答： 1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键,引物过长或过短均会使特异性降低,以18~30bp为宜;引物中C+G含量宜在50%左右;引物内部和引物之间不应含有互补序列;引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%;引物的3'末端与模板...
邰琪15358803733问： 高保真酶,PCR末端加A原理 - ？
安居区小儿回答： 我觉得,有可能是含有普通taq酶的. 3'-5'外切活性是产生高保真性的保证.35外切可以纠错,切除错配碱基保证pcr的高保证性.但是这样也使得一些引物也降解了,为了保证扩增效率,加一些普通taq酶是可以的!
