高保真酶加a尾
基因如何导致蛋白质的合成?
mRNA分子的前体是核不均一RNA(hnRNA),hnRNA的加工修饰主要有四项工作:①加尾,在3′端添加多聚腺苷酸尾巴(poly A)。多聚A的存在保护遗传密码部分不被核糖核酸酶水解,但是多聚A的尾巴依然能被水解,所以多聚A的长短决定了mRNA的寿命。②戴帽,即在5端添加m7GpppG(6-甲基鸟苷三磷酸),这种结构使水解酶无法从5′...
保证DNA复制准确无误的关键步骤是什么?
这样,在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补,形成完整的发夹结构,与亲代DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时,尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。但最近的实验表明,真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制...
人体中除分泌蛋白的其他蛋白质是如何形成的?
多聚A的存在保护遗传密码部分不被核糖核酸酶水解,但是多聚A的尾巴依然能被水解,所以多聚A的长短决定了mRNA的寿命。②戴帽,即在5端添加m7GpppG(6-甲基鸟苷三磷酸),这种结构使水解酶无法从5′端进行水解;③剪接,真核生物转录产生的RNA不是最后翻译时用的模板,其中一些片段会被核酶进行剪切,然后将剩余段落进行...
DNA聚合酶的举例
TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性,可将PCR双链产物的每一条链3'加入单核苷酸尾,故可使PCR产物具有3'突出的单A核苷酸尾;另一方面,在仅有dTTP存在时,它可将平端的质粒的3'端加入单T核苷酸尾,产生3'端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性,可实现PCR产物的T-A克隆法。Tth DNA 聚合酶从Thermus thermophilus ...
基因转录调控
转录开始后，5' capping酶为转录产物5'端加帽，TFIIE和TFIIF先后解离， 延伸因子P-TEFb加入，并磷酸化RNA Pol II的CTD的第2个Ser位点，作为延伸的标志。CTD的第2个Ser位点的磷酸化募集SET2，使H3K36me，募集Rpd3S去乙酰化酶复合物，确保转录起始的保真性。延伸过程中，剪接体对转录产物进行splicing...
分子克隆知识
聚腺苷酸化一般认为是真核细胞特有的加工过程，但是原核细胞中它也会在RNA产物的末尾加上聚腺苷酸。与真核细胞不同的是，在真核细胞中poly(A)通常加在特定的poly(A)信号位点处，而在原核细胞中这个位点不是特异的，比较随机。poly(A)尾巴会加快RNA的降解，这一点与真核细胞也是不同的。由于加...
营山县嘉诺回答： 方法一:直接加0.5ul Taq,70度,10min 即可,但是这种方法效率较低,但是简单,快速. 方法二:PCR产物,切胶回收,浓缩后加10*PCR buffer 1ul, dATP (2mM) 1ul, Taq 0.5ul, 加水至补充体积至10ul,70度 20-30min即可.
冶钥18967774387问： 高保真酶,PCR末端加A原理 - ？
营山县嘉诺回答： 我觉得,有可能是含有普通taq酶的. 3'-5'外切活性是产生高保真性的保证.35外切可以纠错,切除错配碱基保证pcr的高保证性.但是这样也使得一些引物也降解了,为了保证扩增效率,加一些普通taq酶是可以的!
冶钥18967774387问： 为什么PCR产物末端有A? - ？
营山县嘉诺回答： 因为PCR用的DNA聚合酶无5 ' 到 3 '外切酶的活性,校对功能较差,而具备在dNTP过量时,在产物末端添加A,故PCR产物末端有A,若扩增PCR产物较长,需要高准确率时,采用高保真酶,末端不加A 而高保真酶扩增产物要连TA克隆时,可加入Taq酶,在产物末端加A 因为一般PCR采用的是Taq酶扩增,产物末端都有A
冶钥18967774387问： LA高保真酶会在末端加A 吗 - ？
营山县嘉诺回答： 会的.
冶钥18967774387问： 如果不用PCR技术,而是在目的片段上直接加上＂A＂这个碱基,然后导入到T载体中,可不可以呢 - ？
营山县嘉诺回答： 可以的 很多时候你需要使用高保真酶进行扩增,而这类酶缺少在末端加A的功能,所以在PCR反应最后一步72度温育8-10分钟时,加入普通Taq酶进行加A,然后连接T载体
冶钥18967774387问： 设计一个实验,构建一个用大肠杆菌表达拟南芥基因 MS2的载体. - ？
营山县嘉诺回答： 1.设计克隆引物,根据载体图谱(一般的载体都行,如pMD18或19)选择合适的酶切位点2.PCR扩增该全长CDS序列(用高保真酶)3.跑胶后切胶回收质粒,并测定浓度(一般不低于10ng/ul,浓度高转化效率高)4.加A尾(是否加尾依酶而定),4℃连接过夜(可变)5.大肠杆菌感受态细胞转化涂板37℃过夜(~12h)6.挑单菌落做菌落PCR验证,另外取P出来的分别37℃摇菌培养过夜7.提质粒,进行酶切验证,选一或两个阳性的单克隆送公司测序8.测序结果完全正确后,表达载体构建成功
冶钥18967774387问： 平末端DNA加A尾的一些问题~高手请进~(*^ -- ^*) - ？
营山县嘉诺回答： 1 一般不需要,你可以比对你用的高保真酶的buffer和Taq酶的buffer,要加也只能加差异的部分,如果直接加buffer里面离子浓度肯定都不对了; 2 都可以,不过我觉得还是应该在充分延伸后暂停或重新换程序; 3 TA克隆成功说明加A成功;如果要做阳性对照就用Taq酶直接PCR一管; 4 一定要纯化,不然里面全是A,你得到的就大部分是假阳性!
冶钥18967774387问： 片段太长(接近4000bp),用高保真的酶KOD plus扩增,回收后加A了,连不上怎么办啊? - ？
营山县嘉诺回答： 1, 改变PCR产物和TA质粒的比例;转染时多方连接后产物;涂盘时多涂细菌. 2,如果还不行.重新设计引物,在两端加上酶切位点,PCR后用限制性内切酶消化.质粒也同样消化.再连.
冶钥18967774387问： 我的片段是1500bp,为什么总是连不上 - ？
营山县嘉诺回答： 片段是经过酶切还是直接PCR获得的?如果是酶切,需要确认酶切位点正确切下来了,如果不能确认,可以先克隆到T载体上,再从T载体上往下切,保证有充分的保护碱基,以完成酶切.如果是PCR直接获得的片段,连接到T载体,则需要确认片段是否有A尾,如果是用高保真酶扩增的,有些高保真酶不加A尾,需要有一个专门加A的过程再继续连接.如果以上都排除,建议换一下连接酶试一下,当然,载体的质量也需要检查.如果连接产物电泳后,确实发现连接成功了,但是转化却不成功,那就要考虑筛选的抗性,表达的蛋白是否有毒性等问题了.先一步步看看吧.
冶钥18967774387问： Taq酶扩增后3'端为什么加A?什么原理?用Phusion怎么就没有了?？
营山县嘉诺回答： 这是这个酶的特性,由于没有3'-5'外切酶的活性,不能把加上的A去掉.而高保真酶具有3'-5'的外切酶活性,所以一般不会有残留的A
