重叠延伸pcr怎么p不出来
...连不上,谁知道原因呢,这种情况怎么确定退火温度
用PCR连本来难度就很大的，我做过几次都失败了，后来就放弃了。因为我脸上的目的也是做克隆，所以改成将两端分别通过酶切连接到载体上了，两端中间加了个酶切位点。不过我同学有做成功的，他的比较短，所以较容易。
pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则有哪些
PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：PCR的技术的主要步骤：1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的...
什么叫overlap PCR?
重叠PCR,拼全了是重叠延伸PCR或splicing by overlap extension,SOE.,9,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR overlap PCR---PCR 重组,0,
primestarmax可以用作重叠延伸
PrimeSTAR Max DNA Polymerase不仅具有PrimeSTAR HS DNA Polymerase的高扩增效率、高灵敏度和高特异性功能，还具有延伸速度快、保真性能高的PCR用DNA聚合酶。制品本身具有的高退火效率和特别开发的延伸因子使引物的退火时间和延伸时间大幅缩短，实现了PCR反应的高速化。同时，针对由于核酸含量较高而难以扩增的...
pcr延伸时间
较短的片段，如1Kb以内，要1分钟的延伸时间。较长的片段，如3～4kb的靶序列，要3～4分钟的延伸时间。对于扩增10Kb的片段，延伸时间需延长至15分钟。延伸时间过长导致非特异性扩增带的出现，这是在延伸过程中，模板和引物的结合时间增加，引物会结合到非特异性的位点上，导致非特异性扩增产物的形成。
RT-PCR方法怎么样签定纯合子~~
P两锅 一锅是基因LP和RP的，设定好延伸时间，如果T3插入，由于T3较长，则P不出带 另一郭是用T3上的一段引物和RP做PCR，如果T3插入，则能P出条带 如果LPrp P不出来而第二锅P出来了 则是纯合体 如果LPRP和第二锅都P出来了则是杂合体 如果LPRP出来了 第二锅没出 则是野生型 如果都P...
关于pcr扩增
DNA有终止子的，扩增到终止子的地方就停止了。具体终止子怎么把它终止的，看生化课本吧。不同物种的DNA也不一样。一般给你碱基序列的那条模板，假设为A链，它的互补链是B链。第一次延伸：上游引物是识别B链往下延伸的，它延伸出来的碱基序列跟A链一样。下游引物是识别A链往下延伸，它延伸出来的序列...
全基因合成方法
全基因合成技术很成熟,一般的做法是:设计合成相互重叠的单链寡核苷酸,通过重叠延伸PCR法拼接出全长。关于全基因合成方法的资料网上一大堆,单全基因合成的相关专利都上百篇,常见的有重叠延伸PCR(OE-PCR)法[1,7],双不对称PCR(DA-PCR)法[2],聚合酶连反应(PCR)法[3],连接酶链反应(LCR)法[4],热力学平衡由...
pcr过程中如何判断引物的延伸方向?
温度降至60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；延伸阶段：PCR的延伸方向均为5'端至3'端，这是由DNA聚合酶决定的，正向引物和反向引物是相对的，通常以处于DNA双链上游的引物称为正向引物，另一条为反向引物，视觉上看起来像是向右和向左延伸，实际上均为5'端至3'端延伸 ...
PCR的反应包括三个主要步骤
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、延伸：DNA聚合酶...
宿城区红极回答： 因为概率太低了,建议你程序先设置成五个循环94,68,72,时间自定,然后再接正常的PCR循环30个overlapping有好多种做法呢,你试试看不用取出反应液的办法吧,就是我回答里的那五个循环 首先 ,配置体系,酶和引物都加,然后,把第一...
通昭18339801420问： 有没有做重叠延伸PCR时,刚开始扩增两个片段时,扩不出来的? - ？
宿城区红极回答： 普通的PCR只要根据酶的说明书来设定反应时间就可以了,一般TAQ酶每分钟延伸1KB,甲基化pcr是在做pcr之前,将模板DNA做甲基化修饰,pcr反应及电泳步骤都是一样的!我在分子生物学书上看到:延伸时间与产物片段长度有关,产物在1kb以内的延伸时间为1分钟左右,3kb-4kb的需延伸3-4分钟.我的热启动taq酶说明书上举例的pcr反应条件是:94度30s,55度30s,72度1min,72度5min,前三个一起35个循环.
通昭18339801420问： 在做PCR实验时为什么总是P不出条带? - ？
宿城区红极回答： 普通PCR的话有很多影响因素.比如说酶,退火温度,引物设计,变性温度等很多问题.首先说你的模板是不是很复杂,需不需要加入额外的GC enhancer,或者提高预变性的温度.在者,你的退火温度是否合适,一般会选择引物Tm值-5度左右,不行的话可以做一个梯度PCR.然后不你的酶是不是合适,长片段的要长片段的酶,高保真时要保真度高的酶,而Taq酶就很容易做出来了.
通昭18339801420问： 做SOE PCR 无论如何都连接不上,哪位能帮忙想想办法!~~~ - ？
宿城区红极回答： 重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计.可以有三种方法来设计引物,具体如下图所示.引物F及R为基因两端特异引物,其中Fm及Rm为中间引物.其中引物...
通昭18339801420问： 你好,我这两天在做overlap pcr,两个基因都p出来了,退火温度分别为a:58 b:56, - ？
宿城区红极回答： 据我的经验如果你的目的条带没有出来,那100bp处应该是引物二聚体之类的东东,你做第二步PCR的时候先不要加上下游引物,先在比较低的退火温度下扩增10圈,然后再加引物,扩个15圈,如果你重叠部分设计的没有问题,基本上都能扩增出来.不行你就试试touchdown程序,如果还是出不来,肯定是你的引物哪里有问题了.
通昭18339801420问： pcr同样的东西同样的温度,怎么小片段扩出来了,全长就扩不出来 - ？
宿城区红极回答： 本来小片段就比大片段好扩很多.增加延伸时间和反应数,得到微量的全长,再p一次.
通昭18339801420问： pcr电泳问题我的pcr出现不正常现象,好几次第一次都没p出东西来 之后我又用第一次p出来的产物再p,终于p出了正常的条带.然后我想多p一些保存,之后我... - ？
宿城区红极回答：[答案] 我试着帮你分析一下吧,若不对,请见谅. 感觉你还是PCR设置有问题,1调整一下温度,2调整一下循环数和循环时间.因为你毕竟第二次可以P出来,所以试剂、原料,都应该是没问题的. 建议你参考一下,与你做同一个试验或类似试验的相关文章,...
通昭18339801420问： 分段pcr怎么分段?遵循什么原则?我的基因全长是6800左右,以前没做过分段的pcr,请人指教,最好能详细点. - ？
宿城区红极回答： 可以采用重叠延伸PCR方法扩增,把基因分成几段之后,分别扩增、回收,混合后用作模板,然后用全长基因的前后引物进行扩增,设计引物的时候,重合部分不能少于10-15个碱基
通昭18339801420问： 做PCR时,用Taq酶做不出来,用Pfu酶就能做出来 - ？
宿城区红极回答： 你分别做阴阳性对照了吗?如果阳性能扩出才说明没有问题.以前能扩出来不代表现在酶没有问题.一般都是Taq能扩出来,pfu反而扩不出,因为后者高保真效率低一些
通昭18339801420问： 连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶? - ？
宿城区红极回答： 你这个想法理论上讲是可行的,但是实际操作起来就会存在很大的困难.小片段连接比较难做.根据你的叙述,最后连接好的片段约为200bp左右.我建议你把这200bp的片段分成4段,即1,2,3,4段,合成有15个碱基互补的4条引物,1与2,3与4做一次重叠延伸,然后以1与2,3与4的产物为模板,1和4为引物在做一次重叠延伸PCR,这样就ok了,速度会很快的.分成4段是因为引物合成碱基个数小于60个的,按正常收费,这样节约成本.
