overlap实验
作者&投稿：况斌 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
荆看14739262020问： 你好,我这两天在做overlap pcr,两个基因都p出来了,退火温度分别为a:58 b:56, - ？
定西市倍洁回答： 据我的经验如果你的目的条带没有出来,那100bp处应该是引物二聚体之类的东东,你做第二步PCR的时候先不要加上下游引物,先在比较低的退火温度下扩增10圈,然后再加引物,扩个15圈,如果你重叠部分设计的没有问题,基本上都能扩增出来.不行你就试试touchdown程序,如果还是出不来,肯定是你的引物哪里有问题了.
荆看14739262020问： 请问,我用OVERLAP PCR 合成一小片段我要突变的79bp的基因,需要高保真酶吗? - ？
定西市倍洁回答： 呵呵,一定要用高保真酶的,有两点原因:第一,就是第一条回答,高保真能够保障基因扩增引起的不必要突变.(呵呵,如果你的扩增片段全长只有79bp那就无所谓了,但要参照第二条);第二,就是高保真酶不会在扩增的末尾(即3'端)加A,引来后续操作不必要的麻烦.~.~
荆看14739262020问： overlap 一、用这对引物A1 - F:gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2 - R:gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag扩增出片段A,产物长... - ？
定西市倍洁回答：[答案] 亲,仔细看一下,你的B1-F的5'端是不是多了一个t,或者A2- R的3'端少了一个A?这两个引物不是完美overlap唉
荆看14739262020问： 什么是overlap extension pcr - ？
定西市倍洁回答： 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR) 由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来. 此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物. 重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计. 重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用.
荆看14739262020问： 重叠PCR是做什么用的?具体原理是什么? - ？
定西市倍洁回答： overlap-PCR主要在构建载体、拼接DNA片段、制造点突变、或者人工合成DNA片段的过程中用到.具体原理你可以去查一些参考书,说的比较仔细.简单地说就是把A基因3'端的序列加到扩增B基因的上游引物5'端,把B基因5'端的序列加到扩增A基因的下游引物的3'端.分别扩增A、B两基因,这样A的3'端和B的5'端就形成了互补.切胶回收这两个PCR产物,稀释并混合,以此为模板,以A基因的上游引物和B基因的下游引物为引物对,扩增.这样就可以得到AB拼接到一起的产物.
荆看14739262020问： 对于一段有重复序列的片段如何扩增,只是一个基因的中间的部分序列,准备扩增做overlap. - ？
定西市倍洁回答： 1.如果是非特异性扩增引起的无法扩增目的条带,那么可以提高退火温度,或者换酶,或者先切胶回收较浅的目的条带,再次扩增2.如果退火温度太高,可以用两步法扩增3.如果引物GC值太高,可以加DMSO
荆看14739262020问： 全基因合成拿到之后怎么处理 - ？
定西市倍洁回答： 全基因合成拿到之后怎么处理1)反向转录法:这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因,它以目的基因的mRNA为模板,设计上下游引物,借助反转录酶合成碱基互补的DNA片段,即cDNA,再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA...
荆看14739262020问： 泰勒通过哪些著名的实验总结了称为＂科学管理＂的一套思想 - ？
定西市倍洁回答： 泰勒通过(铁铲实验 、搬运实验 、切削实验)著名的实验总结了称为“科学管理”的一套思想. 弗雷德里克·温斯洛·泰勒(1856—1915) 被尊称为“科学管理之父”的人;一个影响了流水线生产方式产生的人;一个被社会主义伟大导师列宁推崇备至的人;一个影响了人类工业化进程的人.泰勒通过(铁铲实验 、搬运实验 、切削实验)著名的实验总结了称为“科学管理”的一套思想.
荆看14739262020问： DNA序列定点突变具体怎么做! - ？
定西市倍洁回答： 可以采用overlap PCR的方法!关键在于引物的设计,在基因工程原理的书上都有!祝你实验顺利!
荆看14739262020问： 细胞因子的活性怎样检测(求实验设计方案)？
定西市倍洁回答： 请看维基百科相关记述: 流式细胞术 维基百科,自由的百科全书 (重定向自流式细胞仪) Jump to: navigation, search Image:03wiki-zn-frontpage-icon.gif流式细胞术正在翻译. 目前已翻译90%,原文在en:flow cytometry.希望您积极翻译与修订...
