流式细胞术的展望

流式细胞技术的发展趋势~

当前，临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点，其发展趋势主要体现在以下几个方面。一．从相对细胞计数到绝对细胞计数 流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群体中亚群细胞的计数，如淋巴细胞可依其表面标志的不同分为T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）、NK细胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴细胞又可进一步分为辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD4-CD8+）等。这些亚群细胞计数过去多以相对百分比表达结果，由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例，并不能体现其在单位体积血液中的绝对数量，而对艾滋病等一些疾病的临床诊断，有时需要考虑细胞的绝对数量，如患者血液中T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+CD8-）的数量200个/μL。T淋巴细胞亚群的绝对计数在国外实验室早已成为常规检查，但在国内仅有少数实验室开展。可以预见，随着干细胞技术的发展，对造血干细胞等的绝对数量分析，不久的将来，也将作为常规检查项目，走出实验室进入临床。流式细胞绝对计数在临床可开展的项目包括：①淋巴细胞亚群，尤其是T淋巴细胞亚群的绝对计数。②外周血或骨髓中造血干/祖细胞的绝对计数。③血液中网织红细胞的绝对计数。④血液中血小板数量，尤其是血小板减少症患者血小板的绝对计数，此种计数优于血细胞分析仪法，已成为血小板计数的国际推荐参考方法。此外，可能出现在血液中的其它一些稀少细胞（如内皮细胞、转移的肿瘤细胞等）的计数，也将发展为流式细胞绝对计数。流式细胞绝对计数的开展对临床疾病的诊断、治疗等有重要意义。二．从相对定量到绝对定量分析 细胞的多种成分如某些抗原或受体表达的流式细胞分析，以前多以平均荧光强度（MFI）或相对荧光强度（RFI）表达其含量。由于流式细胞仪每次的仪器状况可出现差异，每个实验室所用仪器的类型也不尽相同，因此，以MFI或RFI表示细胞抗原或受体的表达量缺乏可比性，虽然流式细胞仪有极高的荧光灵敏度，但却无法准确应用这些信息。近年来，为了通过FCM精确定量分析细胞的某些成分，定量流式细胞术（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐渐得到发展，其定量分析原理主要有两种：①定量抗体微球法：在特制的微球上包被已知分子数的羊抗鼠IgG分子，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子数的混合微球，此微球与待测标本在相同条件下与荧光素标记的单克隆抗体（McAb）反应后在流式细胞仪上测定其荧光强度，根据微球上所包被的羊抗鼠IgG分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程，再将待测样本中阳性细胞的对数荧光强度代入方程即可求得其每个细胞上的平均抗原分子数（抗原结合位点数）。②定量荧光素分子微球法：在特制的微球上直接包被荧光素分子，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同数量荧光素分子的混合微球。在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球及待测细胞的荧光强度，根据微球上所包被的荧光素分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程，再将待测样本阳性细胞的对数荧光强度代入方程，可求得每个细胞上的平均荧光素分子数，根据用于样本测定的单克隆抗体（McAb）与荧光素结合的分子比例，计算每个细胞上的平均抗原分子数。单细胞的抗原或受体定量是流式细胞分析的重要进展，为细胞的生物学、分子生物学、生物化学及免疫学等研究提供了更精确的方法。例如，白血病原始细胞膜的CD45分子表达量低于正常淋巴细胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子数显著高于静止血小板，活化淋巴细胞的CD69分子数显著增高，活化中性粒细胞膜CD64分子数显著高于静止中性粒细胞，强直性脊柱炎患者T淋巴细胞膜HLA-B27分子数明显增高。CD8+T淋巴细胞膜的CD38分子数增高是慢性HIV感染者病情发展或死亡的更有力的预后指标；AIDS治疗有效后，CD8+T淋巴细胞CD38分子数显著降低。三．从单色到多色荧光分析流式细胞分析已从最初的间接免疫荧光染色、单色或双色直接荧光染色，迅速发展到三色、四色甚至五色或六色荧光分析，使得对细胞亚群的识别和分选、细胞功能评价等更为精确。目前，淋巴细胞亚群的分析、白血病免疫表型分析，均应使用至少三色以上的荧光分析才更可靠。例如：辅助/诱导T淋巴细胞四色荧光分析的免疫表型为CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴细胞白血病的异常淋巴细胞的四色免疫表型为CD5+CD10—CD19+CD45+。多色荧光分析是流式细胞技术发展的必然趋势，有条件时应尽可能地采用。四．从细胞膜成份到细胞内成份分析细胞膜免疫表型分析是最重要的流式分析内容之一，很多细胞亚群的检测和分选均是以细胞膜的免疫表型特征为依据，如T、B淋巴细胞和NK细胞分析、白血病免疫分型等。然而，仅有膜免疫表型的分析是不够的，尤其对一些细胞的系列鉴定和功能状态分析常常较为困难，而细胞浆或细胞核内成份的分析则更能反映某些细胞的系列特征和功能变化。随着近年来细胞内成分检测技术的不断完善，细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一个热点。例如，急性髓系白血病性原始细胞浆中检测到髓过氧化物酶（MPO）是最为准确的系列标志，急性B淋巴细胞白血病性原始细胞胞浆中检测到CD79a是最为特异的系列标志；检测T淋巴细胞胞浆内细胞因子合成的种类及含量和膜CD69分子表达，是判断T淋巴细胞活化及其功能的重要手段，而且还能将辅助/诱导T淋巴细胞（Th）进一步分成Th1和Th2亚类，在Th1和Th2细胞浆中可分别合成γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通过细胞内成分检测技术与多色免疫荧光分析方法相结合，可检测不同细胞亚群合成的不同细胞因子（Cytokine），如用五色疫荧光分析血液中淋巴细胞经诱导剂刺激后，辅助/诱导T淋巴细胞亚类—Th1细胞内有细胞因子合成的免疫表型为CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。五．液体中可溶性成分的流式细胞分析 从传统意义上讲，流式细胞技术只能分析细胞及其成分，液体中的可溶性成分则不能进行分析。然而，如果将液体中的可溶性成分结合在一种类似于细胞大小的颗粒（如乳胶颗粒）上，流式细胞仪便可以对其进行分析，这就是近年来发展起来的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技术。CBA的原理是将包被某种抗原或抗体不同大小的微球与待测液体中的相应成分反应形成抗原与抗体的复合物，再加入荧光素标记的第二抗体，微球上结合的待测抗原或抗体分子数量与其荧光强度呈线性关系，由此可对待测液体中与微球上包被抗原或抗体分子相对应的成分进行定性或定量分析，例如同时测定血清或细胞培养液中的多种细胞因子，同时测定血清中多种自身抗体。CBA发展的时间虽很短，目前所能检测的项目还不多，但其发展潜力不容忽视。已知检测细胞因子的方法有多种，包括靶细胞功能分析法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶免疫分析（Elispots）等，但CBA与之相比，其灵敏度极高、可达2pg/ml，而且能同时测定单个标本中的多种细胞因子。六．分子表型分析 分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式细胞技术检测细胞中特异性核酸序列或特异性基因异常。流式分子表型分析与免疫表型分析技术相结合，为所选择细胞亚群的特异性核酸序列（如癌基因、病毒核酸等）检测提供了一种非常有用的工具，具有广阔的应用前景。流式分子表型与免疫表型分析结合的基本技术路线是：①待测细胞首先与特异性细胞亚群的单克隆抗体反应，②固定并渗透细胞，③通过PCR进行引物特异的核酸序列扩增，④应用对扩增产物的特异性寡核苷酸荧光素标记探针进行荧光原位杂交（FISH），⑤加入针对细胞亚群单抗的荧光素标记的第二抗体。⑥流式细胞仪检测及数据分析。例如，流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4+细胞中HIV特异的DNA或RNA，对于AIDS的病程监测、治疗反应以及预后等具有重要价值。流式荧光原位杂交（Flow-FISH）法可测定染色体端粒长度。细胞的染色体端粒是由2~20Kb串联的短片段重复序列(TTAGGG)n和一些结合蛋白组成，端粒长度越长，所含重复碱基数目越多；用荧光素标记的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特异性探针进行FISH后，端粒的长短可以流式细胞仪检测到的荧光强度的高低反映出来；Flow-FISH测定精度可小于3Kb的端粒长度差，对肿瘤的发生与发展、治疗与预后等的研究有一定价值。

流式细胞仪从细胞技术开始发展到今天，60年代至70年代是其飞速发展时期，激光技术、喷射技术以及计算机的应用使流式细胞仪在原理和结构上形成了固定的模式。
80年代则是流式细胞仪的商品化时期，这期间不断有新型号的仪器推出，在多参数检测技术上不断提高。
进入90年代，随着微电子技术特别是计算机技术的发展，计算能力不断提高，流式细胞仪的功能也越来越强大。在数据管理、数据分析方面有了长足进步。但是，在技术原理和设计方面并没有突破性的进展。人们的注意力开始转向流式细胞仪的应用，新的荧光探针、新的荧光染料、新的染色方法不断推出，使流式细胞技术在新的细胞参数分析方面日益发展。
从新推出的仪器看，流式细胞仪会在硬件上不断更新，采用更新的器件（如半导体激光、大规模集成电路），以实现小型化；用数字电路取代模拟电路，充分发挥微处理器的功能以实现简单化；在软件上提高数据自动分析能力，充分发挥图形界面的优点，使操作更加简便。
目前，FCM是定量外周血中HPC的参考方法，广泛应用于外周血干细胞移植实验室，用于决定PBSC采集的时机及评价外周血采集液的收益。其基本原理为荧光免疫分析，即根据外周血与骨髓中HPC表达同样的CD34抗原(CD34+)，并利用荧光标记CD34抗体与HPC膜表面CD34抗原结合，在特定波长的激光照射下，检测CD34+胞发出的荧光强度并结合其光学特性，即较低的侧向散射（SSC）和较高的前向散射（FSC），从而检测CD34+细胞。CD34+细胞实际上包括所有的HPC，如CFU-GM，红细胞暴发形成单位(BFU-E),巨核细胞形成单位（CFU-Mk）,混合细胞集落形成单位（CFU-Mix）和原始细胞集落形成单位（CFU-Blast）。后两种HPC明显具有许多干细胞的特征，如它们可以自我更新，也可定向分化为一定数目的造血细胞系。体内试验也发现，经过致死剂量照射的狒狒移植足够数量的自体CD34+细胞，可以完全恢复其造血功能，同样的现象也可在经过骨髓、摧毁性治疗的病人中出现。有人认为，CD34+细胞在功能上可根据是否表达CD33抗原而分为2个细胞群。早期的HPC，如CFU-Blast和LTC-IC仅表达Q CD34抗原（CD34+/CD33-），而较为成熟的定向祖细胞可同时表达CD34和CD33抗原（CD34+/CD33+）。还有人根据CD38抗原表达与否，将CD34+细胞分为CD34+/CD38-和CD34+/CD38+两个亚型，并且认为LTC-IC主要分布于CD34+/CD38-亚型，而更为原始的ELTC-IC则仅分布于CD34+/CD28-细胞群，说明CD34+/CD38-亚型性质上更接近PBSC。
回顾性资料表面，移植经历了与移植物中不同分化程度的HPC有关的两个阶段。起初，与早期造血恢复有关的是移植 物中定向祖 细胞（committed progenitor cell）；继之，持续性的移植 相由多能造血干细胞产生。因此，周血中不同分化程度的HPC，对指导干细胞采集及移植成功尤为必要。目前多参数及双参数流式细胞低度均可通过CD34、CD33和CD38抗体等检测标本中不 同CD34+细胞亚型，来决定采血的时机和预测移植效果。Barnett等报道，采集液CD34+细胞数量与外周血中CD34+细胞百分率显著相关（r=0.71），并且认为准确计数循环中CD34+细胞，可更好地预测采集液中造血干/祖 细胞含量。Weaver等观察692例患者外周血祖细胞（PBPC）采集液中CD34+细胞、单个核细胞、集落形成单位的数量与移植动力学关系，认为PBPC采集液中CD34+细胞含量是预移植后中性粒细胞和血小板数量回升最有力的指标。虽然，FCM测定CD34+细胞是检测HPC数量的参考方法，但仍有一些技术问题有待解决：（1）单平台分析代替传统双平台分析的可行性；（2）应对单平台FCM分析实验室进行多中心的横向研究；（3）标本制备方法；（4）确定引起移植后快速和长期造血功能恢复的不同干细胞亚型及移植所需数目等。此外，FCM法需特殊仪器，操作技术要求高，价格昂贵，结果的重复性欠佳，促使人们追求更经济、快捷、简便的方法。

---

临洮县15345213429： 流式细胞术的展望 - ？
裴巧密盖： 流式细胞仪从细胞技术开始发展到今天,60年代至70年代是其飞速发展时期,激光技术、喷射技术以及计算机的应用使流式细胞仪在原理和结构上形成了固定的模式.80年代则是流式细胞仪的商品化时期,这期间不断有新型号的仪器推出,在...

临洮县15345213429： 流式细胞技术的发展趋势 - ？
裴巧密盖： 当前,临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点,其发展趋势主要体现在以下几个方面.一.从相对细胞计数到绝对细胞计数 流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群体中亚群细胞的计数,如淋巴细胞可依其表面标志的不同分为T淋...

临洮县15345213429： 临床流式细胞分析的发展趋势如何? ？
裴巧密盖： 临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点,其发展趋势主要体现在:从相对细胞计数到绝对细胞计数不但能够得到测定细胞所占比例,而且计数混合细胞群体中亚群细胞的绝对数量.从相对定量到绝对定量分析定量流式细胞分析的发展,能够精确定量分析细胞的某些成分.从单色到多色荧光分析流式细胞分析从最初的间接免疫荧光染色、单色或双色直接荧光染色,现在已发展为多色荧光分析,对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确.从细胞膜成分到细胞内成分分析随着细胞内成分检测技术的不断完善,细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一个热点.从液体中固体成分到可溶性成分的流式细胞分析.

临洮县15345213429： 流式细胞仪怎么用? - ？
裴巧密盖： 流式细胞仪的结构 流式细胞仪是进行流式细胞分析的仪器,集电子、计算机、激光、流体理论于一体,被誉为试验室的“CT”.流式细胞术(Flow CytoMeter, FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手...

临洮县15345213429： 以分子与细胞为中心了解其最新的发展成果及其应用 - ？
裴巧密盖： 1.流式细胞术的发展历史和工作原理.对该技术与荧光编码微球技术相结合而发展起来的高通量细胞和生化分析技术及其最新发展作了评述.流式细胞术是一种对流动液体中排成单列的细胞逐个进行检测的技术,通过检测得到相应细胞的光散射...

临洮县15345213429： 什么是流式细胞术 - ？
裴巧密盖： 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术.

临洮县15345213429： 流式细胞术可在哪些研究中应用 - ？
裴巧密盖： 流式细胞术主要用在细胞生物学研究中,可以研究细胞表面、胞浆内等的抗原表达情况,细胞大小、细胞内颗粒度.也可以用来研究体液内蛋白的组成情况等.

临洮县15345213429： 流式细胞术简称FCM,是利用流式细胞仪对特定的细胞群加以分选的多参数计量技术.如图甲为一个细胞周期中,运用该技术测得不同DNA含量的细胞分布... - ？
裴巧密盖：[答案] (1)图甲中对细胞进行放射性同位素标记以研究DNA含量变化,而DNA分子特有的碱基是胸腺嘧啶,因此应选择标记胸腺嘧啶(或T). (2)甲图中AB段DNA含量为2N,表示G1期,BC段DNA含量为2N→4N,表示S期,CA段DNA含量为4N,表示分裂...

临洮县15345213429： 流式细胞术在血液病诊断和治疗中有哪些作用? ？
裴巧密盖： FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测 分析,对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的 作用. (1)白血病的诊断和治疗FCM采用各种抗血...

临洮县15345213429： 流式细胞仪的原理是什么? - ？
裴巧密盖： 流式细胞仪(flow cytometer,FCM)是进行流式细胞分析的仪器,它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论、细胞荧光化学技术及单克隆抗体技术于一体,被誉为实验室的“CT”. 流式细胞术则是一种在功能水平上对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析和分选的检测技术,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,具有速度快、精度高、准确性好的优点,是当代最先进的细胞定量分析技术.自1969年第1台流式细胞仪问世,流式细胞术已经发展成为日益完善的细胞分选和分析技术. 生物帮上面有更加详细的介绍,sds-page视频 http://v.bio1000.com/show-844.html