提取pet28质粒时，怎样才能得到高的浓度

pET-28（a）+质粒的提取效果不好？提取量低怎么办？~

最佳答案 回答者：匿名用户 时间:2009-08-28 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛？>>> pET-28（a）+质粒的拷贝数在细菌里本身就是很低，所以和其他质粒相比量会少一些，你可以多摇一段时间，16-18h都没有问题。 略微提高抗生素的浓度，有助于提高拷贝数。还有就是不要用BL21等表达菌提质粒，表达菌多没有endA－突变，质粒的完整性和保真性都不如DH5alpha，TOP10等菌，提取的质量也不高，因为碱裂解时会有大量的多糖干扰，质和量都不如DH5α和TOP10。 铺较高抗生素浓度的板子，重新划线，挑个大点的菌落再摇。培养时候也加大抗生素浓度。

通细菌扩增培养程混杂菌导致含目质粒细菌比例降通挑克隆规模培养提质粒通发现质粒产量错扩增培养质粒提建议挑取克隆鉴定功再用平皿培养功菌液再离比较散克隆再扩增培养提前先提1ml鉴定确认没问题

更换菌种持续现问题更换菌种产受态细胞期扩增产已经退化表型改变换进口受态细胞切恢复

提取pet28质粒时，怎样才能得到高的浓度
Axugen的试剂盒已经很不错了,要是提不出浓度很高的质粒,可以试试下面的一些方法：
1、增加收菌次数,相对提高了质粒的量,这样的话裂解液的量可以适当增加；
2、裂解要充分,变性和复性按说明应该是不超过5分钟,合理控制时间,一般在3分到4分半的时间都是可以的；
3、过柱子时,吸附的时间尽量长一些,可以在这期间做做其他实验或者吃个饭什么的；
4、如果没有必要,不使用去蛋白液,因为每过一遍柱子,其损耗越大,不过这得根据说明的菌种而定；
4、最后洗脱回收的时候,要单方面提高浓度,就要适当减少洗脱液的量,我一般都是回收到40~50 μL的,同时要增加洗脱次数,一般两三次足矣.
如果以上方法都用遍了还无效,就应该考虑菌种本身的问题,是不是冻融或者传代次数过高,导致质粒本身丢失?质粒本身在大肠杆菌的拷贝数是多少?不行的话建议重新将质粒导入到大肠杆菌感受态细胞中.

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长丰县19380927584： 提取pet28质粒时,怎样才能得到高的浓度? - ？
拓容坤净： 常规方法就可以啊,不行就用试剂盒吧

长丰县19380927584： pET - 28(a)+质粒的提取效果不好?提取量低怎么办? - ？
拓容坤净： 最佳答案 回答者:匿名用户 时间:2009-08-28 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛?>>> pET-28(a)+质粒的拷贝数在细菌里本身就是很低,所以和其他质粒相比量会少一些,你可以多摇一段时间,16-18h都没有问题. 略微提高抗生素的浓度,有助于提高拷贝数.还有就是不要用BL21等表达菌提质粒,表达菌多没有endA-突变,质粒的完整性和保真性都不如DH5alpha,TOP10等菌,提取的质量也不高,因为碱裂解时会有大量的多糖干扰,质和量都不如DH5α和TOP10. 铺较高抗生素浓度的板子,重新划线,挑个大点的菌落再摇.培养时候也加大抗生素浓度.

长丰县19380927584： 我们在做绿色银光蛋白GFP的克隆与表达时,用到的办法是酶切法,质粒分别为pET - 28a和N3质粒 - ？
拓容坤净： 通常来说,胶回收和NaAc乙醇沉淀得到的片段应该测浓度或者检验电泳的.毕竟胶回收或者乙醇沉淀都会有损失,而且有时候这类纯化方法收不到核酸.另外下一步连接的时候需要对基因片段和载体进行定量,应该是3:1的时候连接效果比较好.所以才有了定量这一步,个人觉得测浓度和电泳必须做一个,要不连接比较不可靠.

长丰县19380927584： 从菌液提去的pet28a然后酶切,在与目的片段连接前需要纯化不,还是直接就可以连接? - ？
拓容坤净： 如果是用试剂盒提取的质粒,不需要再纯化.如果是双酶切的话,直接就可以连接.

长丰县19380927584： 英语翻译本文通过PCR、转化、提质粒、酶切、连主要接、纯化等步骤构建了质粒pET28a - NULP1.先通过PCR扩增出了nulp1,并将nulp1连接入pMD18 - T载... - ？
拓容坤净：[答案] This aritcle through the steps such as PCR,transformation,distilling plasmid,EcoRI,connecting main links,purification and so on,in order to built the plasmid pET28a-NULP1.First,amplifing the nulp1 thr...

长丰县19380927584： 为什么双酶切pet28a老切不干净 - ？
拓容坤净： 展开全部- 1.pET28a提出来时分子量就很大,8kb左右,不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大,但双酶切后在5.5kb左右

长丰县19380927584： 质粒DNA提取中,什么原因会导致质 - ？
拓容坤净： 首先是你的质粒拷贝数,多的当然好了.低拷贝的可以在收菌前一小时用氯霉素加压筛选下.第二看你是用试剂盒还是手提了,试剂盒的话基本没什么问题,记住几个要点就行.1)溶液2和溶液3加完后混匀要轻柔,越轻越好,否则由基因组污染.2)溶液2和溶液3最好在冰上操作.3)冷结合热洗脱,上柱时温度4度,洗脱时50度-60度.手提的话除了上述几点还要注意RNA的消除,除了LiCl沉淀以外,RNA酶也必不可少,最好37度消1小时以上.别的网上有很多相关的参考,操作时注意些没问题的.

长丰县19380927584： 重组质粒双酶切鉴定 - ？
拓容坤净： 既然你的质粒已经提出来了,那么感受态、转化等因素就不必再考虑了. 你看看双酶切后载体的位置有几条带,如果是两条,那说明酶切不完全,如果是一条,那说明酶切效率没问题. pET28a分子量为5.6k,你的插入片段为500bp,如果你的质粒完全切开,载体和插入片段的摩尔比为1:1,质量比就是5.6k:0.5k,跑胶后两条带的亮度比就是10:1,所以你目的条带很淡非常正常. 换句话说,你的实验一切正常,那条500bp的条带可能本来就应该那么淡.

长丰县19380927584： 有关表达质粒的扩增 - ？
拓容坤净： 你需要把连上了目的基因的质粒 转化(氯化钙化学转化或者电转化均可)进入质粒的宿主(pET系列质粒的宿主是大肠杆菌 表达宿主一般用BL-21型),然后筛选阳性克隆菌株,再用PCR验证目的基因(去掉假阳性,获得真阳性),对真阳性菌株进行细菌培养,其中的质粒自然就被大量复制了.若需要 可从细菌中提取质粒.

长丰县19380927584： ...为获得sufBC融合基因,需要选择图1中的___端,使其带上相同的酶切位点后,利用___获得sufBC融合基因.(4)图2中将构建好的重组质粒sufBC - PET28a... - ？
拓容坤净：[答案] (1)分析题意可知,嗜热杆菌适宜生存在高温条件下,而其它微生物在高温条件不能生存,因此微生物培养过程中,若实验室保存的嗜热杆菌被大肠杆菌污染,可将菌种接种到LB细菌通用培养基上后高温培养,将嗜热杆菌筛选出来. (2)提取嗜热杆...