真菌的DNA提取方法有哪些,要详细操作步骤
菌丝基因组 DNA的提取
取少量菌丝粉,采用 CTAB法提取 DNA,加适量灭菌超纯水 (含 20 pg·ml。RNase)溶解 DNA,37~C处理 l h后, 一20℃保存备用。
菌丝基因组 DNA的提取
取少量菌丝粉,采用 CTAB法提取 DNA,加适量灭菌超纯水 (含 20 pg·ml。RNase)溶解 DNA,37~C处理 l h后, 一20℃保存备用。
1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液,快速振荡混匀
3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!)
4.1000rpm,4℃,5min
5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
6.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 ulTE中
8.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
9.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
10.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ulTE中,-20 ℃保存备用
DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS,
3M NaAc
(二)
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3.加入1 mL 5M KAc,冰浴20 min
4.等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 L TE中
7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ul TE中,-20 ℃保存备用。
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3.加入1 mL 5M KAc,冰浴20 min
4.等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 L TE中
7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ul TE中,-20 ℃保存备用。
DNA提取缓冲液:100 mM Tris-HCl(pH8.0),20 mM EDTA(pH8.0),1.5 M NaCl, 2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2% 巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入
5M KAc
真菌的DNA提取方法:
一、SDS法
基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后,加入高浓度的KAc,0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质,最后用乙醇或异丙醇沉淀。
1、 试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0) EDTA 50mmol/L (pH8.0) NaCl 500 mmol/L 灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/L KAc
(4) RNaseA 10mg/ml
(5) 异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
2、 仪器
离心机, 恒温水浴, 台式高速离心机,电泳装置
3、实验程序
(1)、离心菌体,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
(2)、 向管中加入50μL20%SDS溶液,混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ,65℃保温10min,并不时摇动。
(3)、 加入150μL 5mol/L KAc,混匀,置冰上20-30 min。
(4)、 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,加入0.7V的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30 min 。
(5)、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
(6)、 加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min,除去RNA。
(7)、 C:I抽提后,加2V乙醇,-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
(8)、 用400μL 70%乙醇洗一次后,吹干,加入适量的灭菌ddH2 O或TE溶解DNA。
(9)、 电泳检测完整性。
二、蜗牛酶破壁法
(一)、试剂:
1、500 μL PBS(0.01 mo l/L N a2 HPO4 和N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl)
2、蜗牛酶溶液中(0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12用0.22 μm 细菌滤膜过滤除菌)
3、裂解液(2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl,10 mmol/L T 、Tris-HCl,pH8.0, 1mmol /L EDTA)
4、5mol/L KAc( pH 8.9)
(二)、实验程序
1、离心菌体,沉淀中加入500 μL PBS(0.01 mo l/L N a2 HPO4 和N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl)重悬, 12 000 r /m in 离心2 m in; 弃上清, 重复悬浮一次
2、沉淀溶于100 μL 含20 mg /mL 的蜗牛酶溶液中(0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12用0.22 μm 细菌滤膜过滤除菌)
3、45℃ 作用2 h
4、加100 μL 裂解液(2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl,10 mmol/L T 、Tris-HCl, pH8.0, 1mmol /L EDTA)
5、- 20℃ 冷冻, 然后室温震荡溶解, 反复3次
6、向悬浮液中加入150 μL 5mol/L KAc( pH 8.9)轻轻混匀
7、10 000 r/min离心5 min; 将上清转移到一新的1.5 mL离心管中
8、乙醇沉淀
真菌DNA的提取方法?详细
菌丝基因组 DNA的提取 取少量菌丝粉,采用 CTAB法提取 DNA,加适量灭菌超纯水 (含 20 pg·ml。RNase)溶解 DNA,37~C处理 l h后, 一20℃保存备用。
质粒dna提取试剂盒可以代替细菌dna提取试剂盒吗?
替代使用的可能性 尽管质粒DNA提取试剂盒和细菌DNA提取试剂盒的设计目的不同,但在某些情况下,质粒DNA提取试剂盒可能被用来尝试提取细菌基因组DNA。然而,这种做法可能不适合所有类型的细菌,特别是那些含有复杂细胞壁结构的革兰氏阳性菌,因为它们的基因组DNA可能难以通过质粒DNA提取试剂盒的方法有效提取。结...
dna的提取方法
dna的提取方法:浓盐法、SDS法、CTAB法等。一、 浓盐法。1、根据DNA和RNA在电解溶液中的溶解度不同,可将二者分离。2、常用1 mol\/L NaCl抽提,得到的DNP黏液中加入含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使之乳化,再离心,使蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA则位于上层水相中。3、回收水相,用2倍...
细菌基因组的提取步骤
细菌基因组的提取可以使用专门的试剂盒,原理很简单,首先通过离心的方法获得细菌沉淀,然后使用缓冲液重悬细菌,再加入裂解液将菌体裂解,然后加入RNA酶和蛋白酶,来降解里面的RNA以及蛋白质,随后再使用柱回收的方法,将基因组DNA纯化。
微生物DNA提取的原理和方法是什么?
使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去,蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA。枯草杆菌染色体制备与上类似,但略加修改的方法要适合教学要求。枯草杆菌是格兰氏阳性菌...
煮沸法提取革兰氏阴性菌基因组dna的原理
用煮沸法提速革兰氏阴性菌DNA的原理主要是煮沸法对革兰氏阴性菌破坏彻底,能够更高的释放基因组DNA,因为革兰氏阴性菌细胞壁较薄,所以选用煮沸法提取。
有谁知道:霉菌基因组DNA的提取方法
加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚\/氯仿抽提,以除掉细胞内的蛋白,如与DNA结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀,因为DNA在醇中不可溶而黏在一起,这一步也能除掉盐分。另外,目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。2.细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种;...
细菌的分子生物学鉴定要怎么做?
是的,要做PCR。首先你要提出细菌的DNA。方法如下:1、液体培养及保种:从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡(转速160r\/min)培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中,再加甘油(30-40%)进行保种。(-80摄氏度保藏2年)2、提取DNA(CTAB法):(1)取1.5ml菌液于1. 5ml...
真菌DNA的提取方法?详细
真菌DNA提取方法你可以参考植物的DNA提取的CTAB法,用那个方法同样可以提取真菌的DNA,原始材料就用滤纸吸干培养基的真菌菌丝体就可以。然后,因为真菌菌丝体里含有比一般植物要多的多糖成份,所以你需要在CTAB抽提液里面加入2%左右的PVP或者PVPP,来螯合多糖。如果对CTAB法不了解,你可以追问我。
如何从大肠杆菌中提取染色体DNA
肠杆菌中染色体DNA的抽提 (1)大肠杆菌一级瓶培养过夜,以10%的接种量接二级瓶培养4~5小时后,培养物以50ml\/管离心收获(8 000 rpm,5min,4℃).(2)菌体沉淀中加入10ml BufferA,旋涡振荡混匀,37℃保温30分钟.(3)取出后加入10% SDS至最终浓度为1%,轻轻混匀,37℃保温30分钟澄清即可.(4)取出后...
林索苯酰: 菌丝基因组 DNA的提取 取少量菌丝粉,采用 CTAB法提取 DNA,加适量灭菌超纯水 (含 20 pg·ml.RNase)溶解 DNA,37~C处理 l h后, 一20℃保存备用.
湖南省15116246357: 真菌的DNA提取方法有哪些?要详细操作步骤 - ?
林索苯酰: (一) 1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉 2.加入4mL提取液,快速振荡混匀 3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!) 4.1000rpm,4℃,5min 5.上清用体积的氯仿:异戊醇...
湖南省15116246357: 帮忙找一些从棉籽油中提取棉酚的比较可靠而且新颖的方法.要步骤详细的.方法越多越好.谢谢. - ?
林索苯酰: 真菌的dna提取方法: 一、sds法 基本原理是研磨的组织细胞用热的sds裂解后,加入高浓度的kac,0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质,最后用乙醇或异丙醇沉淀. 1、 试剂 (1)提取缓冲液 tris-hcl 100mmol/l(ph8.0) edta 50mmol/l (ph8.0) nacl 500...
湖南省15116246357: 内生真菌DNA的提取方法 - ?
林索苯酰: 直接提取植物总DNA,用特异性引物扩增就行了;目前还没有新的技术手段,能从植物样品中只提取内生真菌的DNA.
湖南省15116246357: 细菌、真菌、放线菌的DNA提取方法分别有哪些 - ?
林索苯酰: 放线菌(Actinomycets) 是介于细菌与真菌之间的一类微生物,大多为腐生菌,在自然界中分布非常广泛,主要存在于土壤、空气和水中.
湖南省15116246357: 有谁知道:霉菌基因组DNA的提取方法 - ?
林索苯酰: 高中: 原理: 1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA. 2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA. 3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色. 方法步骤: 1.提取细胞核物质:顺时针方向搅拌,稍快,稍重. 5 min 2.溶解DNA: 3.析出含DNA的黏稠物:蒸馏水...
湖南省15116246357: 提取真菌DNA打算提取镰刀菌的DNA,请问用 - ?
林索苯酰: Aidlab的DN41试剂盒采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统,适合于从真菌组织细胞中快速简单地提取基因组DNA.可在30分钟内完成一个或多个100mg新鲜或20mg干燥的真菌样品DNA的纯化工作.提取过程不需要用到有毒的酚氯仿等有机...
湖南省15116246357: CTAB提取植物病原真菌的DNA - ?
林索苯酰: 下游做PCR的话,应该保证模板的纯度,CTAB法提取多半会得到浓度不错但纯度不够的DNA,建议将得到的DNA进行纯化,或者直接使用试剂盒提取,现在的国产试剂盒都还不错的,节约时间又不贵
湖南省15116246357: 微生物基因组提取的方法有哪几种 - ?
林索苯酰: 常见的RNA提取方法有苯酚法、阴离子去污剂法、LiCl一尿素法、改良的Gomez法、异硫氢酸胍法、CTAB法、热硼酸法及改良热硼酸法、TRIZOL试剂快速提取法. RNA提取时,就变性剂的选择来说,CTAB(CTAB法)比异硫氰酸胍(RIZOL试剂法)和 SDS(改良热硼酸法)更有效;就CTAB法来说,由于以CTAB为变性剂,同时加入PVP和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性,使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等,然后再选择性地分离出RNA.