western blot的内参总是做不好。。。老是条带不一致
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有一下三种。第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可；第二种是普通内参，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。第三种，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了），但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。三种同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。
不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C－端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。
actin几种异构体存在组织分布特异性，不同型actin之间具有较高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白，选择作β-actin内参时首先得保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）。那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列。公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原，可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除非肌细胞外,还可以检测cardiac，skeletal，smooth muscle细胞的actin。
western blot能做出内参 没有目的条带就说明至少在操作上是没有问题的
同时，试剂，凝胶，膜，抗体等等都没有问题
那么最大的可能就是抗体未能识别出目的蛋白，故未能做出目的条带
也有可能是组分内的目的蛋白总量太少，未能达到检出限
2，可以第一次做的时候多准备些煮好的样品，上样用一部分，其它冻-20，出来结果后根据结果再调整下一次上样的多少，这样不用重新冻融原来的样品，因为没煮过的样品冻融再测浓度会因为一些蛋白降解和沉淀的问题导致和上次成分不一样，
3，实在不行你就换个内参吧，actin，tubulin，GAPDH，不同的细胞系或者不同的组织有时候真的差挺大的
条带不一致就是蛋白定量做的不准确啊
BCA法，比较精确了
一般sample冻过之后，蛋白量也会改变
最好在做WB之前测一下蛋白量，别直接用之前冻之前检测的数据去做。
1. protein - blot 之前 用Bradford 测一下总蛋白量，估摸一下
2. 做完第一次后，用photoshop 软件测一下 各个内参条带的 光密度值，这样可以给 第二次调整的时候 一个参考....
多的样品下次就少加点 少的就多加点 只要看起来差不多就行了
仲孙受异丙： 内参一般情况下的定义是正常样品中本来就有的相对更为稳定存在分子. 所以,你做好实验的“阳性对照”、“阴性对照”,然后保持与“试验处理样品”同样的样品上样量,再然后对pvdf膜进行剪切以及分别的抗体(内参抗体、目标蛋白的特异性抗体)孵育就可..
雁山区19313441040： western blot 的内参不一致,急求助 - ？
仲孙受异丙： 要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot.因为Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化.虽然,顺利的时候Western Blot做起来...
雁山区19313441040： 我最近急做western blotting,我要的蛋白是120多Kb,内参是GADPH,胶是8%,但是跑胶的时候那个内参总是跑不 - ？
仲孙受异丙： 内参的那个线跑不出来,一样也能曝,因为你的蛋白已经在上面了,只要切胶的时候注意就可以了.另外,你120多的胶没必要用8%,用10%就够了,我200多的kda用10%都可以
雁山区19313441040： western blot等生物学试验中的内参是什么意思? - ？
仲孙受异丙：[答案] western blot用来检测蛋白表达的变化,而检测表达变化的前提就是,你每个孔跑得总蛋白量是相同的,如果上样量都不同,还怎么检测不同组间目的蛋白量的区别,这样内参就可以作为检测蛋白上样量是否相同的标准.内参一般选那...
雁山区19313441040： Western Blot为什么必须要用内参 - ？
仲孙受异丙： 两个主要作用,内参一般为每种细胞都表达的管家基因,内参的亮度可以指示蛋白的量,也就是说跑多个蛋白样品的时候可以用来调平上样量.另外就是可以通过内参条带的美观度来指示你提取蛋白的质量,有无降解等.
雁山区19313441040： Western Blot都可以用beta - actin做内参吗? - ？
仲孙受异丙： 描述有问题.抗体检测的是抗原,所以你检测的是β-actin 做western很重要的一点就是要有一个参照,比如你要检测淋巴细胞某个蛋白的表达,甚至它的变化(比如对某个细胞因子的反应),这时β-actin起到几个作用: 1、如果目的蛋白检测不...
雁山区19313441040： 关于WESTERN BLOT的内参 - ？
仲孙受异丙： 肯定要加二抗啊,内参和你的目的蛋白是一样的,也是一个蛋白,只不过表达比你的目的蛋白在各个组织之间恒定许多,它是你的目的蛋白的一个参照,但是它的作用和mark还不一样,所以内参是一定要要的,否则,人家会质疑你实验的可信性. 如果你的实验动物是大鼠,打个比方一抗是兔抗鼠吧或者其他的什么抗鼠的,二抗就是什么抗兔的,比如说羊抗兔之类,一抗最好买国外的,二抗国内的就可以了
雁山区19313441040： β - Actin抗体是Western Blot很好的内参指数,是啥意思?β - Actin在整个Western Blot的作用是什么?而且能不能详细介绍下Western Blot的抗体了?本人刚... - ？
仲孙受异丙：[答案] 描述有问题.抗体检测的是抗原,所以你检测的是β-Actin做western很重要的一点就是要有一个参照,比如你要检测淋巴细胞某个蛋白的表达,甚至它的变化(比如对某个细胞因子的反应),这时β-Actin起到几个作用:1、如果目...
雁山区19313441040： Western blot 内参跑不齐怎么调整 - ？
仲孙受异丙： 第一,应该确认每个样品表达GAPDH的量一样,虽然是持家基因,本人觉得不同细菌可能表达量不一样,造成信号强弱不一样.可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异,调整上样量一样再检测GAPDH. 第二,内参跑不齐.一般是跑胶...
雁山区19313441040： western blot 的一抗是内参抗体吗 - ？
仲孙受异丙： 内参抗体是个什么鬼? 一抗就是你要检测的目的抗体. GAPDH作为内参的话,也是要孵它的一抗
