wb内参齐的标准

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弥虹15746748121问： WB试验之如何选择内参抗体 - ？
景洪市麝香回答： 你选择的目的蛋白位于什么地方~细胞核 胞质 线粒体~你要观察的是目的蛋白在哪一部分的含量~选择相应的内参~全细胞比如GAPDH HSP90AA1等~还有内参分子量要与目的蛋白分子量有一定差距~避免分不开~当然你可以选择不同种属的抗体来避免这个问题~

弥虹15746748121问： Western blot 内参跑不齐怎么调整 - ？
景洪市麝香回答： 第一,应该确认每个样品表达GAPDH的量一样,虽然是持家基因,本人觉得不同细菌可能表达量不一样,造成信号强弱不一样.可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异,调整上样量一样再检测GAPDH. 第二,内参跑不齐.一般是跑胶...

弥虹15746748121问： wb 中内参齐为什么蛋白就一致 - ？
景洪市麝香回答： = 胞浆蛋白就是胞浆里的蛋白啊……用普通的提取方法就好了,网上一搜一大堆…… 做胞浆蛋白的话,wb的内参一般为β-actin或者gapdh,主要还是要看你的细胞表达哪一个.

弥虹15746748121问： Western Blot为什么必须要用内参 - ？
景洪市麝香回答： Western Blot为什么必须要用内参 要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot.因为Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化.虽然,...

弥虹15746748121问： loading control是什么意思啊? - ？
景洪市麝香回答： 在WB试验中中,最重要和最不可或缺的对照就是内参照(Loading Control,Internal Control). 内参照的使用有两个方面的作用: 1、 是检测整个WB实验过程及体系是否正常工作,如果一个实验连内参照都出不料阳性结果的话(在内参抗体有效的情况下),那么这个体系就是存在问题的了 2、 半定量的标准:内参一般选择的管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中中都是稳定表达的,因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准.

弥虹15746748121问： western blot电泳时内参上样量怎么确定 - ？
景洪市麝香回答： 内参一般情况下的定义是正常样品中本来就有的相对更为稳定存在分子. 所以,你做好实验的“阳性对照”、“阴性对照”,然后保持与“试验处理样品”同样的样品上样量,再然后对pvdf膜进行剪切以及分别的抗体(内参抗体、目标蛋白的特异性抗体)孵育就可以很放心地做后续分析了.

弥虹15746748121问： 什么时候选择线粒体内参抗体? ？
景洪市麝香回答： 我们知道,在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参蛋白,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组...

弥虹15746748121问： 测蛋白知道蛋白标准曲线,求蛋白含量中加样必须定量吗?可不可以加不同量的样(在要求的范围内)？
景洪市麝香回答： 加样一般是保证内参量一致,这样就必须进行定量,使得每孔中的蛋白量一致.虽然现在有很多软件可以测灰度值进行换算,但图是最直观的,内参不齐了别人会在第一时间怀疑你WB的手法~~

弥虹15746748121问： 血清western blot怎样选择内参 - ？
景洪市麝香回答： 网络搜索了解到:1. 由于血浆或血清中很难找到一个稳定表达的蛋白,常见的在组织中比较常用的内参蛋白如肌动蛋白,GAPDH等,严格讲并不适合血浆或血清;2. 可以考虑用立春红染色 或考染做loading control(这种方法在不少文献中都有报道,是大家认可的)3. Blood上有些文章 用的是立春红染色做control

弥虹15746748121问： 如何选择合适的细胞核内参抗体? ？
景洪市麝香回答： Actin是细胞骨架的主要成分,具有高度保守性,在细胞中的表达相对稳定,广泛表达于真核细胞中,大小在42kDa-43kDa之间.研究发现Actin可以调控细胞收缩、调节细胞分裂、细胞器移动、花粉管顶端生长等活动,在植物的幼芽、生长组织、花基、萌发的种子和花序中均稳定表达. 选择合适的植物内参,首先考虑样本来源,植物样本需要选用植物细胞表达稳定的蛋白比如Actin或者Rubisco作为内参;其次要考虑目的蛋白的分子量大小,我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量相差5kD以上,例如某植物目的蛋白大小在50kD左右,就可以选用Actin作为WB实验的内参;最后,从特异性、稳定性以及效价方面考虑,建议选用单克隆抗体更好一些.

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