我问师兄怎么纯化包涵体，他说……

~ 我问师兄如何让蛋白纯度更高，他只告诉我这点……硬核 | 细胞培养笔记如何精读一篇文献献给初学者：如何选择合适的荧光蛋白

在做蛋白表达与纯化的路上，总是充满著各种各样的挑战，要么蛋白无法表达，要么表达的蛋白检测不到……尤其是当纯化的蛋白在包涵体中，不溶，不挂柱，这可怎么办呢？所以，如果前期花点时间优化实验设计，将会大大节约后续纯化的时间，省去不必要的麻烦。比如，要纯化包涵体，首先需要了解…

什么是包涵体？

通常所说的包涵体（Inclusion Bodies, IB），是指细菌（或原核生物细胞）中表达的非结晶、无定形结构的蛋白质聚集体1。在大肠杆菌中表达重组蛋白时，大约有70% 的重组蛋白以包涵体的形式存在2。包涵体无生物活性，难溶于水，但可溶于变性溶剂如尿素、盐酸胍等1。将包涵体溶解后，即可离心并纯化相应的上清。

目前，除离子交换法、疏水法之外，亲和层析法是一种被广泛使用的包涵体纯化方法。将蛋白加上标签后，其可以与连接有配体的层析介质特异性结合，以此分离纯化。在众多的纯化标签中，有两个标签可以用来在变性条件下纯化蛋白——His-tag 和 Strep-tag 。这两种标签都属于重组蛋白表达中常用的标签，至于两者之间的对比，在这里给大家列出一张表格以供参考：

（图片来源：哺乳动物细胞表达的难点和解决方案，都帮你整理好了）

为了比较两种标签的实际纯化效果，这里做了两个小测试。分别在天然条件和变性条件下，将mCherry， GAPDH 或目的蛋白，与标签His6-tag 和Twin-Strep-tag® 重组，表达后，在两种标签各自的纯化条件下进行纯化，跑胶观察结果。

在配体的选择上， His6-tag 重组蛋白使用 Ni-NTA 纯化， 而 Twin-Strep-tag® 重组蛋白则使用填料Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XT（IBA Lifesciences，德国）进行纯化。

（图片来源：iba）

Twin-Strep-tag® 标签搭配 Strep-Tactin®XT 组合而成的第三代 Strep-tag® 高效蛋白纯化系统（如下图），有接近共价的高亲和力。

（图片来源：iba）

Protocol

克隆与表达

1. 将编码mCherry，GAPDH 和目的蛋白克隆至表达载体中（IBA Lifesciences），构建Twin-Strep-tag® 和His6-tag 重组蛋白表达载体，后将载体分别转化至大肠杆菌BL21 中，表达并收集菌体（IBA Lifesciences Protocol PR86-0001）。在含氨芐青霉素的 LB 或 HD 培养基中培养菌体，并以合适的光密度诱导。 2. 收集菌体并重悬于缓冲液中。 His-tag 重组蛋白使用Ni-NTA Lysis Buffer（50 mM NaH2PO4，pH 8.0,300 mM NaCl 10 mM 咪唑）; Twin-Strep-tag 重组蛋白使用Buffer W（100 mM Tris / HCl，pH 8.0,150 mM NaCl ; 使用1 mM EDTA）。 3. 超声破碎，并离心。

纯化

「天然条件：mCherry，GAPDH」

1. 使用 Ni-NTA Lysis Buffer 和 Buffer W 分别平衡 1 mL Ni-NTA，Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XTSuperflow® 纯化柱，后将得到的蛋白上清液取 3 mL 加入柱中。 2. 使用2 CV（Column Volume, 柱体积）的Ni-NTA Wash Buffer（50 mM NaH2PO4，pH 8.0,300 mM NaCl 20 mM 咪唑）清洗Ni-NTA 柱4 次，1 CV 的Buffer W 将两个Strep -Tactin® 柱清洗8 次。 3. 使用 0.5 CV 的洗脱液洗 6 次。

洗脱液：Ni-NTA：50 mM NaH2PO4 pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM 咪唑 Strep-Tactin®：Buffer E（Buffer W + 2.5 mM 脱硫生物素） Strep-Tactin®XT：Buffer BXT（Buffer W + 50 mM 生物素）

变性条件：目的蛋白

1. 室温条件下，细胞沉淀在缓冲液中持续搅拌溶解 15~60 分钟，后离心。 缓冲液：Buffer W：（含有 8M 尿素，Twin-Strep-tag®） Buffer B：（100 mM NaH2PO4 pH8.0 10 mM Tris / HCl 8M 尿素; His-tag） 2. 上柱前，使用 Buffer W 将溶解的蛋白稀释至尿素浓度为 4M 和 6M, 用于 Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XT 纯化。 3. 使用含有适当浓度尿素的 Wash Buffer 平衡纯化柱 1 mL Ni-NTA，Strep-Tactin®，和 Strep-Tactin®XT。取含之前有蛋白的上清，加入柱中。 4. 使用 1 CV 含有尿素的 Buffer W 或 Buffer C 清洗纯化柱，反复清洗直到 A 280 nm 低于 0.1 或者达到恒定为止。 5. 使用 0.5 CV 的洗脱液洗 6 次。 洗脱液：Ni-NTA：Buffer D1 ：100 mM NaH2PO4， pH 5.9， 10 mM Tris / HCl 8M 尿素：Buffer D2（pH 4.5 的 Buffer D1）用于洗脱第二步。 Strep-Tactin®：Buffer E + 尿素 Strep-Tactin®XT：Buffer BXT + 尿素

最后通过 SDS-PAGE 分析所有洗脱组分，并用 Nanodrop 测蛋白浓度。

结果

对比 SDS-PAGE 分析，可发现 Strep-tag® 系统使用流程简便，在天然还是变性条件下纯化的蛋白，纯度皆高于 His-tag 系统。

– 比较第三代 Strep-tag® 系统 （左）与 His-tag 系统（右）在 native 条件下，纯化 mCherry 及 GAPDH 蛋白的表现

无论是 mCherry 或是 GAPDH，使用 Strep-tactin®XT : Twin-Strep-tag® 都能得到纯度较高的目标蛋白（见 Elution）。

Western blot 分析结果显示，提取 mCherry 所出现的杂质为其降解产物。

（图片来源：iba）

比较 His-tag 系统（左）与第二、三代 Strep-tag® 系统（中、右）在变性条件下，纯化不同蛋白的效果

使用第三代 Strep-tactin®XT 能在使用 6M 尿素的变性条件中，获得大量高纯度的蛋白；相对而言，使用 Strep-tactin® 仅能得到极少量蛋白。

而使用 Ni-NTA 虽然能在将 pH 值调降至 4.5（E2）情况下，纯化蛋白，但得到的最终产物仍含有许多杂质。

（图片来源：iba）

因此，综合下来我们可以发现，Strep-Tactin®XT：Twin-Strep-tag® 在天然条件下和变性条件下纯化的蛋白都有很高的纯度。

操作上，His-tag 系统在洗脱时需要不同 pH 的 2 种 Buffer 来达成。而 Strep-Tactin®XT 的操作步骤则较为简单，且 Buffer 中不含咪唑，不会干扰 260/280 nm 的测定，也省去后续除咪唑和脱盐等步骤。更多资料表明，Strep-Tactin®XT 不仅能在温和的纯化流程中产出高纯度（纯度>95%）、高产量的目标蛋白，且能保持目标蛋白的活性。此纯化系统在有表面活性剂的环境中也有良好的纯化表现，柱子可以多洗几次，不会造成目标蛋白流失。即便是量少的蛋白或是膜蛋白，也有良好的纯化效率。

（图片来源：iba）

同时Strep-Tactin®XT 还可用于变性条件下的纯化，或WB/ELISA，侦测目标蛋白，还可用来固定目标蛋白，检测蛋白质交互作用，或是更进一步用以筛选治疗用蛋白，工业用酵素等等，具有广泛的应用领域。

（图片来源：iba） 参考文献： 1. Palmer I, Wingfield PT, 2004: Curr Protoc Protein Sci. 38:6.3:6.3.1–6.3.18. Preparation and Extraction of Insoluble (Inclusion-Body) Proteins from Escherichia coli. 2. Yang Z, Zhang L, Zhang Y, Zhang T, Feng Y, Lu X, et al. (2011) Highly Efficient Production of Soluble Proteins from Insoluble Inclusion Bodies by a Two-Step-Denaturing and Refolding Method. PLoS ONE 6(7): e22981. doi/10.1371/journal.pone.0022981 文章来源：iba 题图来源：站酷海洛 话题： 包涵体, 蛋白

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岑巩县18710822456： 包涵体蛋白纯化步骤是怎样的 ？
释凭固特： 常规的做法是先洗涤包涵体,包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂,如2M尿素在50mM Tris,pH7.0-8.5,1mM EDTA中洗涤包涵体.此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白.同时,因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl,使包涵体的纯度达到50%以上.洗涤完之后,再将包涵体用高浓度的变性剂进行溶解,将溶解的变性蛋白过柱子纯化.还有的就是省掉洗涤包涵体步骤,直接用变性剂溶解后,然后去纯化.不过这种一般比较适合带有亲和标签的蛋白,如His标签.上海纽普生物他们做蛋白复性还是很有经验的,据说他们的技术人员以前都是搞蛋白质结构的.

岑巩县18710822456： 纯化蛋白形成包涵体,怎么办 - ？
释凭固特： 取决于所需蛋白的用途,如果是测活性的话 那就得更换载体或者菌株 甚至诱导条件 使包涵体的量尽可能少;或者变性纯化 然后复性 但是此方法复性的蛋白活性会丢失很大 基本上活性丢失 也不排除还有活性的可能;如果是用来做抗体或者其他的不需要活性实验 直接变性纯化就行.

岑巩县18710822456： 包涵体蛋白纯化?？
释凭固特： 可以先进行蛋白浓缩处理,如果你觉得必要,但我个人在上柱之前从不浓缩,干吗要多一个步骤呢,层析本来就会有浓缩的作用.2. 蛋白浓缩方法在实验室做还是PEG比较简单,只需要一个透析袋就够了.但我个人喜欢超虑,不好意思.不...

岑巩县18710822456： 重组蛋白包涵体复性和亲和纯化的方法?重组蛋白包涵体复性和亲和纯化 ？
释凭固特： 可以先用超声破碎法将细胞(或细菌)破碎,释放出包涵体,破碎效果可以通过显微镜进行检测;然后经离心取上清溶液,一般而言重组目的蛋白存在于上清溶液中,可以用电泳方法进行检测.再用适当方法进行分离纯化蛋白,其中包括蛋白的复性.重组蛋白分离纯化方法包括分子筛层析、离子交换、疏水层析、亲和色谱等方法.

岑巩县18710822456： 请教膜蛋白包涵体表达纯化复性 - ？
释凭固特： 您好!您这里可能有些概念错误. ① 包涵体就是蛋白的变性聚集后的产物,6M盐酸胍及8M尿素是作为溶解包涵体的溶剂. ② 复性的过程是逐步去除盐酸胍或者尿素,从而使得蛋白天然构象逐步形成. 所以一般如果起始使用的是6M盐酸胍进行包涵体溶解,这个过程中逐步降低的是盐酸胍的浓度.梯度离心或者差速离心去除细胞碎片,一般1000r/min左右就差不多可以达到效果.包涵体是表达过快的蛋白来不及折叠而形成的蛋白团,所以一般蛋白纯度能够达到95%以上,用6M盐酸胍就基本把包涵体分开,再超滤一下加上缓冲液就基本上很纯了

岑巩县18710822456： 细菌flag蛋白纯化用什么菌株和载体 - ？
释凭固特： 3,重复(3)的步骤进行SDS-PAGE分析;ml 卡那霉素存储液,若转化DH5α.当需要表达蛋白时.750μl20mMTris-HCl,Western 印迹;ml乙酰BSA(根据需要补足水到30μl2)37℃温浴2-4h3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度4)消...

岑巩县18710822456： 抗体蛋白质纯化的好方法 - ？
释凭固特： 抗体纯化分了几种类型,根据用途决定选择哪种方法进行纯化: 1. 粗纯:将制备抗体的血清或是腹水,细胞上清,直接用盐析法进行处理,这样可以将这些物质里面的其他杂质去掉,获得蛋白的成分,但是由于是粗纯,里面会混有大量的其他...

岑巩县18710822456： 基因工程生产的分泌型白蛋白如何提纯 - ？
释凭固特： 分泌型蛋白的话应该比其它类型蛋白易纯化吧.以前构建过一个分泌型蛋白,但发现这种类型的不好之处就是产量太低,用比较丰富的培养基又会向包涵体方向发展.你的问题应该补充说下你的蛋白的等电点是多少?有什么特征?分子量大小等,别人才可以给你出主意.一般是“硫酸铵沉淀+离子交换+透析”比较多吧,相对比较便宜.我之前用过亲和层析发现花销太大,其实纯度这东西要看你下游是做什么的了,如果不是做动物实验或细胞面的,只需要该蛋白的生物学活性的话无必要一味追求太大的纯度.不同性质的蛋白用不同的方法,具体问题具体分析.

岑巩县18710822456： 如何确定重组蛋白是否为包涵体蛋白 - ？
释凭固特： 大多或者只在沉淀中存在. 难以用普通的上清纯化办法获得蛋白.