外植体如何选择和消毒？常用消毒剂有哪些？有什么特点

植物组织培养中外植体的常用消毒剂有哪些？ 灭菌时间是什么 使用的时候要注意些什么呢？~

常用的消毒剂列于下表 中。 常用消毒剂

其中70%～75%酒精具有较强的杀菌力、穿透力和湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入, 因此常与其他消毒剂配合使用。由于酒精穿透力强，应严格掌握好处理时间，时间太长会引起处理材料的损伤。 选择适宜的消毒剂处理时，为使其消毒效果更彻底，有时还需与黏着剂或润湿剂配合使用，使消毒剂能更好地渗入外植体内部，达到理想的消毒效果。

1.外植体的建立
（1）外植体的选取 组织培养的外植体，一般分为两类：一类是带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，在组织培养过程中可直接诱导促进丛生芽的大量产生，其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易于保持材料的优良性状。另一类主要为根、叶等营养器官及花药、花瓣、花托、胚珠、果实等生殖器官。这类外植体大都需要一个脱分化过程，经过愈伤组织阶段再分化出芽或产生胚状体然后形成再生植株。
在快速繁殖上，最常用的外植体是茎尖。通常切块在0.5厘米左右，太小，产生愈伤组织的能力较弱；太大，则在培养器皿中占空间太多。如果为培养无病毒苗而采用的外植体，通常仅取茎尖分生组织部分，其长度常在0.1毫米以下。
（2）外植体的消毒 由于外植体大都采用外界生长的植株，常带有各种微生物，如带入培养基，会迅速繁殖而形成污染，导致培养工作的失败。因此，外植体消毒是必不可少的工作，消毒既要杀灭外植体上的病菌，又不能伤害材料而影响其生长。由于材料不同，栽培条件、季节等不同，不同外植体消毒应选用各自合适的消毒剂种类、消毒剂浓度、消毒时间及处理程序。
理想的消毒剂应有较强的杀菌能力，并应具有易去除而不易伤害外植体的特点。常用的有次氯酸钠（0.5%～10%）和漂白粉（1%～10%）滤液，能分解产生具杀菌作用的氯气，并自行散发到空气中，只要浓度得当，一般不会伤害外植体。双氧水（3%～10%）也易分解而不易伤害外植体。酒精（70%）具较强的渗透力和杀菌作用，且易挥发，但会杀死组织细胞，所以消毒时间不宜过长。常用酒精先消毒几秒钟，有利其他消毒剂渗入材料发挥杀菌作用。
消毒方法和程序因材料不同而异。通常先用酒精（70%）浸数秒，取出后置于10%次氯酸钙饱和上清液浸10～20分钟或2%～10%次氯酸钠溶液浸6～15分钟，取出后用无菌水冲洗3次。
2.外植体的增殖
外植体的增殖是组培的关键阶段。接种后的培养容器在培养室中，一般每天光照16小时，1500～3000勒克斯，温度在25℃左右进行分化培养。在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，还需要进行继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖培养1个月左右后，可视情况进行再增殖，经一次又一次的继代，即可增加植株数量。
继代培养中由于外植体本身来自无菌环境，不需要消毒，操作较方便。但由于继代培养中外植体分化能力会逐渐下降，所以继代培养代数也不是无止境的。
3.根的诱导
继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转移到生根培养基上进行生根培养。生根培养基较多用1/2MS培养基，因为降低无机盐浓度有利于根分化。此外，生根培养基在激素种类和浓度上与增殖培养基有较大差异，主要如细胞分裂素、生长素等，一般细胞分裂素抑制生根而生长素促进生根。
一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。此外，生产中也有用具根原基试管苗，即只在生根培养基中培养7～10天，诱导根原基或小于1毫米的幼根后即用于移植。由于其基部切口已愈合而形成根原基，不易感染，且栽后能很快生根，具较高的成活率。
4.组培苗的炼苗移栽
生根或形成根原基的试管苗从无菌，光、温、湿稳定环境中进入自然环境，从异养过渡到自养过程，必须经过一个驯化锻炼过程，即所谓炼苗。
一般移植前，先将培养容器打开盖子，于室内自然光照下放3天，然后取出苗，用自来水将根系上琼脂冲洗干净，再栽入已准备好的基质中。基质常用泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等或适当加部分园土，使用前最好用高温或药物消毒。移栽前期要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度90%左右）。但注意基质不宜过湿，更不能积水，以防烂苗。此外，温度对成活率影响也很大，以15～25℃最适宜，夏季温度过高，水少小苗易萎蔫，水多又易腐烂，管理较困难，成活率下降。炼苗4～6周，新梢开始生长后，小苗即可转入正常管理。

消毒剂的的选择和消毒处理时间长短取决于植物材料对消毒剂的敏感性，越幼嫩或越敏感的植物材料处理时间不宜过长，也不宜采用强消毒剂。

使用高锰酸钾还应注意，由于高锰酸钾分解放出氧气的速度慢，浸泡时间一定要达到5分钟才能杀死细菌。配制水溶液要用凉开水，热水会使其分解失效。

配制好的水溶液通常只能保存两小时左右，当溶液变成褐紫色时则失去消毒作用。故最好能随用随配。该品有刺激、腐蚀性。 工业应用：该品主要用做氧化剂。

高锰酸钾：

性状与稳定性：该品为黑紫色细长的棱形结晶；带蓝色的金属光泽；式量158.04。味甜而涩。密度2.703克/立方厘米。高于240℃分解，在沸水中易溶，在水中溶解，易溶于甲醇、丙酮，但与甘油、蔗糖、樟脑、松节油、乙二醇、乙醚、羟胺等有机物或易的物质混合发生强烈的燃烧或爆炸。

水溶液不稳定。该品水溶液不稳定，遇日光发生分解，生成二氧化锰，灰黑色沉淀并附着于器皿上。高锰酸钾溶液是紫红色的。

以上内容参考：百度百科-消毒剂

1、选择优良的种质

无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。

2、选择健壮的植株

选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。组织培养用的材料，最好是从生长健壮的无病虫的植株上选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。

3、选择适宜的部位

植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功，这些部位包括茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难脱分化，或者再分化频率很低。

4、选择适当的时期

组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。

花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。

叶子花的腋芽培养，如果在1～2月采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3～8月采集，萌发的数目多，萌发速度快。对于大多数植物而言，应在其生长季节开始时采样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。

5、考虑器官的生理状态和发育年龄

一般认为，生理年龄小的幼嫩组织较生理年龄大的成熟衰老组织具有较高的形态发生能力。随着组织年龄的增加，器官的再生能力逐渐减弱甚至完全失去再生能力。

6、材料大小的选择要适宜

建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小为0.5～1.0 cm，如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。

组培中常用酒精和升汞消毒。Ziv等用0.3%升汞代替Ca（ClO）₂进行消毒，可降低鹤望兰的褐变程度。一般来说，延长外植体消毒时间会使消毒效果增加，但对外植体伤害也大，从而加剧褐变。因而消毒时间应掌握在一定范围内，才能保证较高的外植体存活率。

酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。升汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。

外植体所处状态

植体取材的不同状态具体表现为外植体生理状态、取材部位、取材时期、外植体的大小及受伤程度、外植体预处理等。幼龄材料比成龄材料褐变轻，这可以用幼龄材料的酚类化合物含量少，而成龄材料多来解释。

平吉成在研究小金海棠、八楞海棠和山定子刚生成的实生苗上切取茎尖进行组培的试验中，发现接种后褐变很轻。高度分化的叶片作为外植体，接种后则很容易褐变，而在幼嫩器官或组织（如胚）中，褐变则较轻。

以上内容参考：百度百科-外植体、百度百科-植物组织培养

消毒剂的的选择和消毒处理时间长短取决于植物材料对消毒剂的敏感性，越幼嫩或越敏感的植物材料处理时间不宜过长，也不宜采用强消毒剂。一般植物材料首先在消毒前除去泥土或死组织，然后用水冲洗除去外部污染物，然后剥除外层表皮或组织。消毒时可先在70%酒精中浸泡数秒以除去空气气泡，用1.0%次氯酸钠消毒10~30分钟，或或用0.1%升汞消毒5~15分钟，之后用无菌水冲洗3~5次后接种。所用消毒液与外植体体积大致为1比10。有时为了增强消毒效果，可以采取以下一种或几种办法：将植物材料在灭菌前用十分清洁的流水（或自来水）冲洗0.5~2小时，在消毒剂中加入1滴或数滴吐温-20或80（浓度为0.08%~0.12%），在消毒过程中不时搅拌或振荡，在真空中进行消毒，多种消毒剂多次消毒处理或复合消毒处理，采用杀虫剂和杀菌剂进行表面消毒处理或适量地加入培养基

1、常用的消毒剂按成分分类主要有9种：含氯消毒剂、过氧化物类消毒剂、醛类消毒剂、醇类消毒剂、含碘消毒剂、酚类消毒剂、环氧乙烷、双胍类消毒剂和季铵盐类消毒剂;按消毒效果分类有3种：高效消毒剂、中效消毒剂、低效消毒剂。当今社会提倡无毒环保，环凯推出了高效环保消毒剂。
2．常用化学消毒灭菌方法
（1）浸泡法
选用杀菌谱广、腐蚀性弱、水溶性消毒剂，将物品浸没于消毒剂内，在标准的浓度和时间内，达到消毒灭菌目的。
（2）擦拭法
选用易溶于水、穿透性强的消毒剂，擦拭物品表面，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。
（3）薰蒸法
加热或加入氧化剂，使消毒剂呈气体，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。
适用于室内物品及空气消毒或精密贵重仪器和不能蒸、煮、浸泡的物品（血压计、听诊器以及传染病人用过的票证等），均可用此法消毒。
①纯乳酸
常用于手术室和病室空气消毒。每100m2空间用乳酸
12ml加等量水，放入治疗碗内，密闭门窗，加热熏蒸，待蒸发完毕，移去热源，继续封闭2
小时，随后开窗通风换气。
②食醋
5－10ml/m3
加热水
1－2m3
，闭门加热熏蒸到食醋蒸发完为止。因食醋含
5％醋酸可改变细菌酸碱环境而有抑菌作用，对流感、流脑病室的空气可进行消毒。
此外，尚可应用甲醛或过氧乙酸等进行熏蒸灭菌
（4）喷雾法
借助普通喷雾器或气溶胶喷雾器，使消毒剂产生微粒气雾弥散在空间，进行空气和物品表面的消毒。如用
1％漂白粉澄清液或
0.2％过氧乙酸溶液作空气喷雾。对细菌芽胞污染的表面，每立方米喷雾
2％过氧乙酸溶液
8ml
经30分钟（在18℃以上的室温下），可达
99.9%杀灭率。
（5）环氧乙烷气体密闭消毒法
将环氧乙烷气体置于密闭容器内，在标准的浓度、湿度和时间内达到消毒灭菌目的。
环氧乙烷是广谱气体杀菌剂，能杀灭细菌繁殖体及芽胞，以及真菌和病毒等。穿透力强，对大多数物品无损害，消毒后可迅速挥发，特别适用于不耐高热和温热的物品，如精密器械、电子仪器、光学仪器、心肺机、起博器、书籍文件等，均无损害和腐蚀等副作用。本品沸点为10.8
℃,
只能灌装于耐压金属罐或特制安瓿中。

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安溪县15541559338： 组培外植体消毒的问题 - ？
少环至灵： 组培外植体用次氯酸钙、双氧水、硝酸银溶液浸泡灭菌后,需要用无菌水冲洗几分钟后才能接种,不能不无菌水冲洗就接种,以免残留的消毒药物对外植体造成影响.