平板菌落计数法的说明
平板菌落计数法,是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下:将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂布到平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞;统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
1.操作方法:以无菌操作取检样25g(或25ml),放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨制成1:10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min,制成1:10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混合均匀,制成1:100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管,按上项操作顺序,制10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
2.无菌操作:操作中必须有“无菌操作”的概念,所用玻璃器皿必须是完全灭菌的,不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装,应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟,每个平板不得超过15个菌落。
3.采样的代表性:如系固体样品,取样时不应集中一点,宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨,液体样品须经过振摇,以获得均匀稀释液。
4.样品稀释误差:为减少样品稀释误差,在连续递次稀释时,每一稀释液应充分振摇,使其均匀,同时每一稀释度应更换一支吸管。
在进行连续稀释时,应将吸管内液体沿管壁流入,勿使吸管尖端伸入稀释液内,以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
为减少稀释误差,SN标准采用取10mL稀释液,注入90mL缓冲液中。
5.稀释液:样品稀释液主要是灭菌生理盐水,有的采用磷酸盐缓冲液(或0.1%蛋白胨水),后者对食品中已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品(如酱油)进行稀释,可以采用灭菌蒸馏水。 1.操作方法:根据标准要求或对污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在制10倍递增稀释的同时,以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做两个平皿。
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml,并转动平皿,混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。
待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48±2h,取出计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。
2.倾注用培养基应在46℃水浴内保温,温度过高会影响细菌生长,过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴,应以皮肤感受较热而不烫为宜。
倾注培养基的量规定不一,从12~20ml不等,一般以15ml较为适宜,平板过厚可影响观察,太薄又易于干裂。倾注时,培基底部如有沉淀物,应将底部弃去,以免与菌落混淆而影响计数观察。
3.为使菌落能在平板上均匀分布,检液加入平皿后,应尽快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min,以防止细菌有所死亡或繁殖。。
4.培养温度一般为37℃(水产品的培养温度,由于其生活环境水温较低,故多采用30℃)。培养时间一般为48h,有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度,琼脂平板培养48h后,培养基失重不应超过15%。
5.为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆,不易分辨,可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板,不经培养,而于4℃环境中放置,以便计数时作对照观察。
在某些场合,为了防止食品颗粒与菌落混淆不清,可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培养后菌落呈红色,易于分别。 1.操作方法:培养到时间后,计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数,计算处原始样品中每克(或每ml)中的菌落数,进行报告。
2.到达规定培养时间,应立即计数。如果不能立即计数,应将平板放置于0-4℃,但不得超过24h。
3.计数时应选取菌落数在30~300之间的平板(SN标准要求为25~250个菌落),若有二个稀释度均在30~300之间时,按国家标准方法要求应以二者比值决定,比值小于或等于2取平均数,比值大于2则其较小数字(有的规定不考虑其比值大小,均以平均数报告)。
4.若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300,则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30,则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300,有的又小于30,但均不在30~300之间,则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长,则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。
5.不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比(同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近),即稀释倍数愈高菌落数愈少,稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象,则应视为检验中的差错(有的食品有时可能出现逆反现象,如酸性饮料等),不应作为检样计数报告的依据。
6.当平板上有链状菌落生长时,如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限,则应作为一个菌落计,如存在有几条不同来源的链,则每条链均应按一个菌落计算,不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长,该平板一般不宜采用,如片状菌落不到平板一半,而另一半又分布均匀,则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
7.当计数平板内的菌落数过多(即所有稀释度均大于300时),但分布很均匀,可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。
8.菌落数的报告,按国家标准方法规定菌落数在1~100时,按实有数字报告,如大于100时,则报告前面两位有效数字,第三位数按四舍五入计算。固体检样以克(g)为单位报告,液体检样以毫升(ml)为单位报告,表面涂擦则以平方厘米(cm)报告。
菌落总数的计算方法
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嘉峪关市13273597697: 平板菌落计数法的特点 - ?
武良核黄: 1. 操作比较繁琐 2. 只能检测活菌 3. 由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞,所以,长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞.因此平板菌落计数的结果往往偏低.
嘉峪关市13273597697: 平板菌落计数法分几种类型 - ?
武良核黄:[答案] 1、平板倾注法\x05\x05 1)、以无菌操作,将检样25g(或25ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水的广口瓶内(瓶内置有适量玻璃珠)或灭菌研钵内,经充分振摇或研磨用成1:10的均匀稀释液. 2)、用1.0ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1.0ml,沿管壁徐徐注...
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武良核黄: 是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的.取一定容量的菌悬液,作一系列的倍比稀释,然后将定量的稀释液进行平板培养,根据培养出的菌落数,可算出培养物中的活菌数.此法灵敏度高. 2.湿重法系单位体积培养物经离心后将湿...
嘉峪关市13273597697: 平板涂布菌落计数法和倾倒平面培养基菌落计数法的区别 - ?
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嘉峪关市13273597697: 食品微生物平板计数长了霉菌怎么计数 - ?
武良核黄: 平板菌落计数法,是种统计物品含菌数的有效方法.方法如下:将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂布到平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞;统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数. 但是,由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞,所以,长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞.因此平板菌落计数的结果往往偏低.为了清楚地阐述平板菌落计数的结果,现在已倾向使用菌落形成单位(cfu:colony-forming units),而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量.