质粒DNA的小量制备 注意哪些操作 为什么
提取方法都是大同小异的，只要操作上注意量都不会差别很大。所以主要还是看菌液的状态。
如果想抽多一些，就摇多些菌液，一般如果是大质粒，用5ml以上菌液摇，多次离心用一管收集，相应增加溶液一二三的量即可。
另外，个人经验认为，一般摇16个小时菌的生长状态比较好。
1.在使用前,在溶液Ⅳ（洗涤液）加入40ml无水乙醇,然后在瓶盖上作好记号.
2.溶液Ⅱ（lysis buffer）在温度较低时,可能会产生沉淀,需先用水浴加热溶解,混匀后再使用.溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化,用完后应立即盖紧瓶盖.
3.最后加水溶解质粒时,可先将水加热,提高溶解度.
质粒DNA的小量制备注意事项：
如有必要，在酶切反应液中加人1 μl 10 mg/ml RNA酶溶液（不含DNA酶）以去除污染的RNA。
在使用前,在溶液Ⅳ（洗涤液）加入40ml无水乙醇,然后在瓶盖上作好记号。
溶液Ⅱ（lysis buffer）在温度较低时，可能会产生沉淀,需先用水浴加热溶解，混匀后再使用.溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。
最后加水溶解质粒时，可先将水加热,提高溶解度。
质粒DNA的小量制备的步骤：
细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。必要时可以离心2次。
将细菌沉淀重悬于150μl用冰预冷的溶液I中，加入1/50体积RNAseA贮存液，剧烈振荡，使之完全分散。
溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)
不含dna酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分装贮存
注：（1）溶液I高压蒸气灭菌后，贮存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；但提取大于15kb的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；（3）务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分；（4）震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提高效率；（5）配制RNaseA贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；（6）溶液I每2个月重新配制1次。加200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS
注：（1）若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；（2）不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA；（3）每2个月重新配制1次。加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻微震荡混匀
溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml
注：（1）所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；（3）每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈震荡混匀。
12000g离心5分种，将上层液体转移到另一离心管中。
注：为了保证不吸出下层液体，可以先离心30秒，然后将上层与少量下层液体吸至另一离心管，离心5分种，再转移上层液体。切勿混入下层液体。加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。12000g离心5~10分钟，小心吸去上清液。
注：（1）沉淀即为质粒DNA；（2）为确保质粒完全沉淀，异丙醇的体积可以适当加大至62~65%。0.8ml70%乙醇洗涤DNA沉淀后，小心地吸去上清。在空气中静置3~10分钟，待沉淀干燥后，溶解于50μl高压灭菌的水中。
注：为洗涤充分，可以洗2次。取1~2μl样品测定紫外吸光度，对所得质粒进行定量并了解其纯度，或取1~2μl样品进行琼脂糖电泳，估计其纯度和得率。
提取质粒的主要步骤
闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL(小量制备)，多至250mL(大量制备)菌液的...
质粒的分离操作
二、质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。(一)、煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000转离心30秒。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上...
在植物组织培养中,什么叫液体培养基的重悬?
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。质粒DNA的小量制备中 碱裂解法需要将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液...
小提质粒质粒很好,为啥大提质量很差
纯度达不到细胞转染级别。质粒小提就是小量制备，小量抽提了，提取的方法有碱裂解法等，也可以用小量质粒提取的纯化柱，质量很好，大提质提取出来的DNA量比较少，纯度达不到细胞转染级别，只能用于后续的酶切，测序等等工作，导致不如小提质粒那么好，质量很差。质量差法是一种在化学计算中利用反应前...
求分子克隆具体实验步骤一份~~多谢各位大侠啦~
二.载体的制备 1.质粒DNA的制备:用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒。 2.载体酶切(100ul) 质粒DNA 2ug 10xBuffer Tango 10ul E1 2ul E2 2ul ddH2O 补足至100ul 反应条件:一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h,pET系列37℃水浴过夜。 3. 琼脂糖凝胶电泳检测:取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀...
博凌科为 高纯质粒小量制备试剂盒试用注意事项?及工作原理是怎样的...
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大提质粒原理
但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液...
生物化学实验中制备质粒DNA方法中,酚氯仿裂解法的实验原理
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单个...
DNA测序技术的操作
(2) 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说,并不能给出一个可信的DNA浓度估计,混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此,分光光度法常常错误地高估DNA浓度。 (3) DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸,虽然它们在电泳后DNA样品的前面,并不能观察到,但...
凝胶问题
其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。细菌质粒小量提取试剂盒的原理还是碱裂解法小量制备细菌质粒的原理，你可以了解一下，试剂盒里面是用硅基质来吸附核酸分子。三条带可以做切胶回收，以切胶回收的DNA分子为模板，pUC19质粒...
国昨替硝： 1.在使用前,在溶液Ⅳ(洗涤液)加入40ml无水乙醇,然后在瓶盖上作好记号. 2.溶液Ⅱ(lysis buffer)在温度较低时,可能会产生沉淀,需先用水浴加热溶解,混匀后再使用.溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化,用完后应立即盖紧瓶盖. 3.最后加水溶解质粒时,可先将水加热,提高溶解度.
额尔虎市15241926075： 质粒DNA的制备(小量提取)原理和操作步骤是怎么样的? ？
国昨替硝： 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于20℃冰箱中20分钟,然后4℃下12000g离心10分钟
额尔虎市15241926075： 质粒DNA少量快速提取的注意事项有哪些呢? ？
国昨替硝： 3.提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等
额尔虎市15241926075： 质粒提取过程中,应注意哪些操作,为什么? - ？
国昨替硝：[答案] 1.提取过程应尽量保持低温.2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提.3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全.沉淀DN...
额尔虎市15241926075： 影响本实验结果的因素有哪些质粒dna的小量制备 ？
国昨替硝： 1.在使用前,在溶液Ⅳ(洗涤液)加入40ml无水乙醇,然后在瓶盖上作好记号.2.溶液Ⅱ(lysis buffer)在温度较低时,可能会产生沉淀,需先用水浴加热溶解,混匀后再使用.溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化,用完后应立即盖紧瓶盖.3.最后加水溶解质粒时,可先将水加热,提高溶解度.
额尔虎市15241926075： 从大肠杆菌中制备少量质粒的流程 - ？
国昨替硝： 大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术,但提取方法有很多种,以下介绍一种最常用的方法: 碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用e69da5e6ba...
额尔虎市15241926075： 在质粒DNA的提取过程中,应注意哪些操作,为什么? - ？
国昨替硝： 非本人原创,转载自网络.认真看.质粒提取需要注意的提到了. 溶液I,50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8.0; 溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS; 溶液III,3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸. 让我们先来看看溶液I的作用.任何生物化学反应,首先...
额尔虎市15241926075： 小量制备质粒DNA时发现质粒DNA不能被限制酶所切割,可能的原因是什么?怎么解决? - ？
国昨替硝： 3)将离心管放入煮沸的水浴中,时间恰为40秒. 8)小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出.再将附于管壁的液滴除尽.除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面....
额尔虎市15241926075： SDS碱裂解法制备质粒DNA的具体操作步骤是怎么样的?那位大侠给力点,帮下忙？
国昨替硝： 我给 说 我 实验室 简易操作:1.收菌 菌液 试管 倒入1.5mlEP管 10000rpm/min 30s离 离 转速 必 间 必 免难 悬浮 必要 收两 离 弃 清 残留菌液尽量扣干 2.悬浮菌液 用200/250ul碱提Ⅰ液(确定已加入RNAse)悬浮沉淀 振荡器 振荡悬浮 目 制 均 菌...
额尔虎市15241926075： 质粒DNA的提取方法总共有哪些,回答的全给高分??? - ？
国昨替硝： 碱裂解法: 此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析.方法如下: 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基. 2、37℃振荡培养过夜. 3、取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3...
