为什么常以4℃的温度作为保存菌种的适宜温度？

为什么常以4℃的温度作为保存菌种的适宜温度？~

将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3-5℃低温干燥处或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6个月时间移植转管一次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境温度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇菌种外，其他食用菌菌种都能采用此法保藏。

微生物在其最低生长温度下代谢活动减弱，处于休眠状态，维持生命而不发育。因此常以4℃左右的温度作为保存菌种的适宜温度。

菌种保藏方法大全

基本原理
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

保藏方法大致可分为以下几种：

1．传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5．冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

三、器材

细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；

肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；

灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点

下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。

1．斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
2．液体石蜡保藏法

（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。

（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。
此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。
3．滤纸保藏法

（1）将滤纸剪成0．5×1．2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟。

（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。

（3）取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

（6）将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。

（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。
细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

4．沙土保藏法

（1）取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。

（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。

（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。

（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。

（9）于每支沙土管中加入约0．5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。

（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。

（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。

（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。

（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。
5．液氮冷冻保藏法

（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。

（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌15分钟。

（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图Ⅶ-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

6．冷冻干燥保藏法

（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图Ⅶ-15），大小要求外径6—7．5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，备用。

（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7—10天。

（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0．2ml。
（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2>）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。

（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。

抽气一般若在30分钟内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持压力6—8小时即可。

（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（图Ⅶ-17）继续抽气，约10分钟即可达到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。

不同的菌种保存时温度也不一样的
一般在4℃左右保存的，原因是4℃刚好低于这类菌种的最适宜生长繁殖的温度
在4℃时，既能保持菌种的活性，又能在一定程度上减缓其繁殖速度

微生物在其最低生长温度下代谢活动减弱，处于休眠状态，维持生命而不发育。因此常以4℃左右的温度作为保存菌种的适宜温度。

低温下生物代谢会降低。
4摄氏度是水的反常膨胀的最低温度，再往下，水分子开始向晶态转变，也就是结冰。
为了不把菌种不小心变成冰渣渣，4摄氏度大概是最标准的温度了，低一两度也没什么问题，在可控范围内就可以了。

因为在这个温度条件下。菌丝体生长非常缓慢。有利于延缓菌丝体衰老。

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台江县15162876798： 为什么常以4℃的温度作为保存菌种的适宜温度? - ？
资哑益肺： 低温下生物代谢会降低. 4摄氏度是水的反常膨胀的最低温度,再往下,水分子开始向晶态转变,也就是结冰. 为了不把菌种不小心变成冰渣渣,4摄氏度大概是最标准的温度了,低一两度也没什么问题,在可控范围内就可以了.

台江县15162876798： 在食品生产常常以4℃这样温度下保存,这个温度是怎么得来的 - ？
资哑益肺： 物理学研究表明水在4°C的时候体积是最小的,这个温度下保存食品既不会使微生物分裂太快导致食物腐烂,也不会因为水结冰导致盛放食物的容器破坏和导致营养成分的分子形态破坏.

台江县15162876798： 菌种保存的意义 - ？
资哑益肺： 一个菌种的分离纯化非常的费时费力,所以分离到后必须保存好,便于应用于生产和科研,免得要用时再去分离.有一般得4度斜面保存还有是超低温的液氮保存,一般的科研机构都会有保存.

台江县15162876798： 为什么巴士杀菌在0~4度贮存 - ？
资哑益肺： 巴氏灭菌法(pasteurization),亦称低温消毒法,冷杀菌法,是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法,现在常常被广义地用于定义需要杀死各种病原菌的热处理方法.【由来】巴氏灭菌法的产生来源于...

台江县15162876798： 、菌种贮存条件 - ？
资哑益肺：[答案] 菌种保藏技术 菌种是主要的生物资源,也是食用菌生产首要的生产资料.一个优良的菌种被选育出来以后,必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变,才不至于降低生产性能,能长期在生产中使用.因此,菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义. ...

台江县15162876798： 菌株的菌株的保存使用 - ？
资哑益肺： 1、新引进的菌种经形态、染色、培养性状、生化特性等的鉴别确定后作记录,并进行保存.2、长期保存的储存菌株以冷冻干燥保藏为主,特殊要求的菌种可用其它方法进行保存,保存期可长达几年至几十年.3、半储存菌株以含20%甘油的肉...

台江县15162876798： 为什么制备感受态不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从 - 70℃或 - 20℃甘油保存的菌种中直接转接 - ？
资哑益肺： 原因是多次转接的细菌,其性状很可能发生改变;而储于4℃的培养菌,细菌仍处在低水平的代谢状态下,细菌容易发生老化或退化,最直接的表现就是细菌状态较差.所以制作感受态时,最好选择保种较早,保种时状态较好,并且最好是存储在-70℃的深低温冰箱中的菌种为宜.

台江县15162876798： 如何贮藏食用菌的二、三级菌种? - ？
资哑益肺： 菌种贮藏是指各级菌种成为可用的成品后,暂时不用而采取的防止污染和减缓老化进程的措施和方法.菌种贮藏是以食用菌的生物学特性为基础实施的,较高的温度使菌丝细胞生理代谢加快,加速老化;光可刺激子实体原基的形成,从而消耗菌种的大量养分.所以,菌种贮藏原则上要避免高温,降低温度,阻止光照,阻断这些因素对菌种的不良影响. 原种和栽培种体积大,数量多,专业菌种场应建专门冷库用于菌种的贮藏,多数菌种在1~4℃的贮藏温度下可贮藏2~3个月;非专业菌种场和栽培者,要尽量制造低温、洁净、干燥、黑暗的条件来贮藏.原种和栽培种长满后,在室温下可自然贮藏10~20天,不影响其使用效果.超过这个期限,则需要创造条件进行贮藏.

台江县15162876798： 常见的食品保藏方法有哪几种? - ？
资哑益肺： 菌种的优劣是食用菌生产成败的关键.菌种是国家重要的生物资源,也是微生物工厂首要的生产资料.由于微生物繁殖快、易变异,因此微生物菌种特别需要妥善保藏.世界各国对微生物菌种都很重视.中国科学院微生物研究所专门设立了菌种...

台江县15162876798： 下列有关菌种保藏的叙述中,错误的是() - ？
资哑益肺：[选项] A. 频繁使用的菌种,可用斜面培养基保藏在4℃的冰箱中 B. 临时保藏菌种的培养基不需要定期更换 C. 长期保藏的菌种,需要降低代谢和变异发生概率 D. 长期保藏菌种时,可各取lmL灭菌甘油和培养菌液混合后保存在冷冻箱中