Touch-down PCR与普通的PCR有什么区别

什么是降落PCR（touchdown PCR）？~

博凌科为-为你解答：降落PCR（即touchdown PCR）是一种增加PCR反应特异性的优化方法。一般情况下，解决PCR非特异性扩增的方法是通过调整Mg++浓度或改变退火温度等来实现的，但这些方法既烦琐又耗时，Touchdown PCR利用一种简单的手段克服了这些复杂的问题。其基本原理是：设计多循环反应程序以使相连循环的退火温度越来越底。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物摸板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些生产目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异性杂交的Tm值，但此时目的扩增物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在Touchdown PCR中，必须应用热启动技术（hotstart）。编设Touchdown PCR程序的目的是要涉及一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。例如：如果一对引物的计算Tm值为63℃，可设定PCR仪的退火温度从66℃降到50℃（每两个循环降低退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。如果在Touchdown PCR中，持续出现假象带表明起始退火温度太低，或者目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，和（或）非目的扩增物以更高的效率扩增。把退火温度每降低1℃时所需要的循环数增加到3或4，有可能在非目的产物开始扩增以前给目的产物增加竞争优势。这时，应从程序的末尾去掉相应的循环数，以避免过度循环扩增产物的降解和产生高分子量成片产物。

touchdown PCR是为了增加反应的特异性，降低非特异产物的产生。在整个反应过程是一个温度由高到低的过程，在温度降低的过程中，会出现一个温度是上下游引物最适的退火温度，大量引物与模板结合，由此产生特异性产物；温度继续降低时，未结合的引物已很少或没有，非特异性产物就很少或没有。
设置温度时，高温以Tm较高的引物为准，低温以Tm较低的引物为准.
我常用的程序是：65C----50C, 1C/2s(2s 降低1度）

Touch down(TD)PCR是一种特殊技术。采用它我们可以不需做预实验来进行条件选择，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。
其基本操作是：根据对引物Tm值的计算，确定一个退火温度的大范围（不是一个点，而是一个可以跨越10～20度的范围），计算的Tm值应落在这个范围中间。在做扩增周期程序设定时，让退火温度从选定范围的最高温度开始逐步降低温度，每次降低一度，最后结束在选定范围的最低温度处。在每一个停留温度上循环两次。这样，引物在某一较高温度下与模板复性并引发延伸合成产物，通常是特异性扩增产物，因为它是在最早也即Tm值较高的条件下引发合成的，在随后退火温度继续下降的过程中，上述的延伸合成会继续进行。可以想象，在退火温度下降过程中，很有可能引物还会在模板上找到第二个复性并引发延伸的部位，但是由于该位点是在更低的Tm值下与引物复性的，故通常是“假阳性扩增”。这两个产物在含量上有极大区别。如果特异性扩增带与假阳性带之间的Tm值相差3度，由于在每个温度上进行两次循环，故特异性较高的合成产物经过了6次循环后假阳性产物才开始合成，故特异性产物的量大于假阳性产物的64倍（26），两者在量上是不难区别的。

touch down pcr就是降落pcr，可以选定一个温度范围，如50——35，每个温度2循环，然后在50度15循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适用。

降落PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性，循环在比估算的Tm高大约5度的退火温度下开始，然后每循环降低1度到2度，直到退火温度低于Tm5度。只有同源性高的目的摸板会被继续扩增 ，这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。降落PCR对于那些不了解引物和目的摸板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。

这是标准的touchdown PCR

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宿迁市19721626542： Touch - down PCR与普通的PCR有什么区别 - ？
鲍葛银杏： Touch down(TD)PCR是一种特殊技术.采用它我们可以不需做预实验来进行条件选择,只需要做一次正式实验,就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的,绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果. 其基本操...

宿迁市19721626542： touch down PCR - 搜狗百科？
鲍葛银杏： 优点:可以富集引物与模板正确配对的产物,在起初的几个循环中,特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍 用途:获得低拷贝的目标序列,用oligo-dT引物做RT-PCR,在引物和模板特性未知的情况下做PCR

宿迁市19721626542： pcr提高退火温度,增加产物特异性 - ？
鲍葛银杏： 是的,你这个如果退火温度提高效果还是不好,建议采用touch down方法,具体程序是你原来是55摄氏度退火,现在61摄氏度第一次退火,每次循环减少1摄氏度,直到53摄氏度,之后用53摄氏度并完成所有反应

宿迁市19721626542： pcr的问题 - ？
鲍葛银杏： 退火温度是最重要的,退火时正是你的引物加到已经解链的单链DNA上,这个时候退火温度高了,特异性强,但是产物量可能低.退火温度如果低了,则引物可能会错配,造成非特异性产物的产生.

宿迁市19721626542： pcr有哪些类型?rt - ？
鲍葛银杏：[答案] 热启动PCR Touch-down PCR RT-PCR 兼并引物PCR 巢氏PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 连接酶链反应 RACE-PCR AFLP 免疫-PCR(immuno-PCR) MSP甲基化特异PCR

宿迁市19721626542： PCR设计引物时出现 Two - temperature PCR recommended: (70°/94°).怎么办 - ？
鲍葛银杏： 这是该软件建议用2步PCR.要看你用的taq酶的活性温度.如果是70°,就可以用.你这个情况我建议试试这2种方法:touch-down PCR 和 nested PCR.或者把引物的位置向外挪一点,不要刚好在基因的起始点.“两对引物的上下游Tm值相差都在10左右”,PCR是可以出来的.

宿迁市19721626542： PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因 - ？
鲍葛银杏： 1. 模板的用量在你这种情况下应该和目的条带浓度关系不大——记得realtimePCR的原理图么,循环数够多时,目的片段的终浓度在不同模板量条件下相差不大; 2.首先考虑扩增效率问题,可用touch down PCR,除开头几个循环外,后面的退火...

宿迁市19721626542： 什么是不对称PCR - ？
鲍葛银杏： 是PCR的一种,与普通PCR的差异主要是使用的引物并不等量,一般两个引物的比例是20-100:1,这样获得产物并不是双链DNA,而是来产生了大量的单链DNA(SSDNA). 这个主要是用于生产杂交过程中所需的探针等

宿迁市19721626542： 普通PCR和梯度PCR的关系 - ？
鲍葛银杏： 梯度PCR其实就是把很多的PCR放在一起做,不用一次一次的作很多次 可以很快的找出最适合的退火温度,或者说可以在最适合的退火温度下扩增出目的条带