自然界分离微生物的一般操作步骤?土样的采取, 预处理, 培养, 菌落的选择产品的鉴定
自然界的微生物,几乎都是混杂在一起的。人们要想观察、研究和利用某一种微生物,就必须将它从各种微生物混生的环境中分离开来。所以微生物的分离是一项十分重要的技术。
一、分离的基本方法
微生物分离的方法很多,主要有连续稀释分离法,平板划线分离法和单细胞分离法等方法。其中,单细胞分离法需要贵重精密仪器,中学无法开展,而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行,中学完全具备开展条件。现将这两种方法说明如下。
1.连续稀释分离法
①取1克土样,在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内,充分摇匀,将菌分散。
②用移液管吸取上述菌悬液1毫升,放入盛有9毫升无菌水的试管中,并进一步稀释成1000倍,即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8(每1次稀释,都须更换移液管)。
③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液,分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内,同一稀释液重复做3个培养皿。
④将温度为45~50℃的营养琼脂培养基(其成分和配制方法见本章第三节)倒入上述各培养皿内,轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀,凝固后,将培养皿倒扣放置在温暖处(28℃左右),每天观察培养基表面有无微生物菌落。
⑤经过一定时间培养后,培养基上长出菌落,根据菌落特征,初步判断属于何种类型的微生物,并在显微镜下检查,若菌体形态一致,则可认为是初步分离到纯菌种。
⑥将分离培养所得的纯菌种,从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。
2.平板划线分离法
①取1克土样,在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中,堵塞棉塞,制成菌悬液待用。
②取一培养皿置于实验台上,左手将培养皿打开稍许,向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10~12毫升,轻轻转动培养皿,使其中的培养基分布均匀,平放桌上,使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。
③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态,在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时,用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液,迅速送入培养皿内,在平板培养基的一边,作第1次平行划线 6~7条,转动培养皿约70°角,用烧过冷却的接种针,通过第1次划线部分作第2次平行划线,然后再用同样方法,作第3次平行划线。划线时,应使平板培养基表面向下,以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘,也不要将培养基划破。
④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养,待长出菌落后,鉴定微生物类群,并根据镜检结果,判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯,则可转移到斜面培养基上进一步培养。
连续稀释分离法和平板划线法,均须在无菌室或接种箱内进行。
二、各类微生物的分离
1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌
其分离方法见本节“分离的基本方法”
2.从土壤中分离放线菌
①制作高氏一号培养基,趁热注入培养皿中,凝成平板,待用。
②称取土壤10克,放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中,并加入10%酚10滴,以抑制细菌生长。振荡10分钟,制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法,进一步制成10-3菌悬液。
③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液,注入平板培养基上,用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于25~30℃温箱中,培养7~10天,培养基上会出现微生物菌落。如果菌落的硬度较大,干燥致密,且与基质紧密结合,不易被针挑起,这就是放线菌菌落。
④挑取放线菌菌落,接种于斜面培养基上。
3.从土壤中分离霉菌
①制作豆芽汗葡萄糖培养基,并添加80%乳酸数滴,以抑制细菌生长。将培养皿中,凝成平板,待用。
②称取10克土壤,按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上,用玻璃刮刀涂抹均匀。然后将培养皿倒置于25~30℃温箱内培养3~4天。培养基上会出现微生物菌落。霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状,可根据这一特征寻找霉菌菌落。
④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上。
4.从饮水中分离大肠杆菌
①制作伊红美蓝培养基,趁热注入培养皿中,凝成平板,待用。
②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水,按1:10稀释。
③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。
④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18~24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落,菌落中心呈暗蓝黑色,发金属光泽。
⑤将菌落接种于斜面培养基上(由营养琼脂培养基制成)。
一、微生物工业对菌种的要求
(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定:生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。
(二)、微生物工业对菌种的要求是:
(1)菌株高产,在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;
(2)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;
(3)生长繁殖能力强,较强的生长速率,产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;
(4)能够高效地将原理转化为产品;
(5)能利用广泛的原材料,并对发酵原料成分的波动敏感性小;
(6)对需要添加的前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;
(7)在发酵过程中产生的泡沫要少;
(8)具有抗噬菌体的能力;
(9)遗传稳定性,
二、工业用微生物菌种的来源及选育
(一)微生物菌种的来源
一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选:
(1)是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;
(2)从大自然中采集样品分离;
(3)从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。
当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
(二)微生物工业菌种的分离
1、野生菌株的分离、筛选过程
(1)新菌种分离与筛选的步骤
菌种分离的流程如下:
标本采集 →标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏
①采样
采样季节:以温度适中,雨量不多的秋初为好。
采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
②标本预处理
④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。
⑤高产菌株的筛选:这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定,
⑥毒性试验:据有的国家规定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,其他微生物作为食用,均需通过两年以上的毒性试验。
2、菌种的分离方法
(1)施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同,如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物生长,而不利于其他种类微生物的生存,以达到使目的菌种占优势.而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧,可将好氧微生物和厌氧微生物分开;通过控制温度,可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开;控制pH,可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时,可加入抗真菌抗生素;分离真菌时,可加入抗细菌药物。
(2)随机分离方法
有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用,因此常采用随机分离方法分离。
A、抗生素产生菌的分离
抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌:采用抗生素的敏感菌,传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。
B、抗肿瘤药物产生菌的分离
抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法:生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤,微生物发生突变。
B1、生化诱导法:将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下,当DNA损伤时,诱发λ阻遏物CI分解,PL启动子启动lacZ基因转录,测定表达的ß-半乳糖苷酶活性,来检测药物的存在。
B2、SOS生色检测法:利用当DNA损伤时,可活化yecA蛋白,进而分解噬菌体的阻遏蛋白,再引起sifA基因启动lacZ基因转录,测定表达的ß-半乳糖苷酶活性,来检测药物的存在。
C、生长因子产生菌的分离
以氨基酸产生菌为例,介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物(如亚胺环己酮)的分离培养基中生长,然后采用影印法,将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中。
微生物分离的方法很多,主要有连续稀释分离法,平板划线分离法和单细胞分离法等方法。其中,单细胞分离法需要贵重精密仪器,中学无法开展,而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行,中学完全具备开展条件。现将这两种方法说明如下。
1.连续稀释分离法
①取1克土样,在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内,充分摇匀,将菌分散。
②用移液管吸取上述菌悬液1毫升,放入盛有9毫升无菌水的试管中,并进一步稀释成1000倍,即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8(每1次稀释,都须更换移液管)。
③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液,分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内,同一稀释液重复做3个培养皿。
④将温度为45~50℃的营养琼脂培养基(其成分和配制方法见本章第三节)倒入上述各培养皿内,轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀,凝固后,将培养皿倒扣放置在温暖处(28℃左右),每天观察培养基表面有无微生物菌落。
⑤经过一定时间培养后,培养基上长出菌落,根据菌落特征,初步判断属于何种类型的微生物,并在显微镜下检查,若菌体形态一致,则可认为是初步分离到纯菌种。
⑥将分离培养所得的纯菌种,从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。
2.平板划线分离法
①取1克土样,在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中,堵塞棉塞,制成菌悬液待用。
②取一培养皿置于实验台上,左手将培养皿打开稍许,向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10~12毫升,轻轻转动培养皿,使其中的培养基分布均匀,平放桌上,使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。
③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态,在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时,用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液,迅速送入培养皿内,在平板培养基的一边,作第1次平行划线 6~7条,转动培养皿约70°角,用烧过冷却的接种针,通过第1次划线部分作第2次平行划线,然后再用同样方法,作第3次平行划线。划线时,应使平板培养基表面向下,以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘,也不要将培养基划破。
④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养,待长出菌落后,鉴定微生物类群,并根据镜检结果,判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯,则可转移到斜面培养基上进一步培养。
连续稀释分离法和平板划线法,均须在无菌室或接种箱内进行。
二、各类微生物的分离
1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌
其分离方法见本节“分离的基本方法”
2.从土壤中分离放线菌
①制作高氏一号培养基,趁热注入培养皿中,凝成平板,待用。
②称取土壤10克,放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中,并加入10%酚10滴,以抑制细菌生长。振荡10分钟,制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法,进一步制成10-3菌悬液。
③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液,注入平板培养基上,用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于25~30℃温箱中,培养7~10天,培养基上会出现微生物菌落。如果菌落的硬度较大,干燥致密,且与基质紧密结合,不易被针挑起,这就是放线菌菌落。
④挑取放线菌菌落,接种于斜面培养基上。
3.从土壤中分离霉菌
①制作豆芽汗葡萄糖培养基,并添加80%乳酸数滴,以抑制细菌生长。将培养皿中,凝成平板,待用。
②称取10克土壤,按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上,用玻璃刮刀涂抹均匀。然后将培养皿倒置于25~30℃温箱内培养3~4天。培养基上会出现微生物菌落。霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状,可根据这一特征寻找霉菌菌落。
④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上。
4.从饮水中分离大肠杆菌
①制作伊红美蓝培养基,趁热注入培养皿中,凝成平板,待用。
②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水,按1:10稀释。
③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。
④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18~24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落,菌落中心呈暗蓝黑色,发金属光泽。
⑤将菌落接种于斜面培养基上(由营养琼脂培养基制成)。
微生物浸出法脱硫的装置有哪些分别有什么作用
此外,日本工业技术研究院生命工程工业技术研究所与石油产业活化中心联合开发出了柴油脱硫的新菌种,此菌种可以同时脱除柴油中的二苯并噻吩和苯并噻吩中的硫,而这两种硫化物中的硫是用其它方法难以脱除的[11]。[1] BDS过程是以自然界产生的有氧细菌与有机硫化物发生氧化反应,选择性氧化使C-S键断裂,...
废气生物处理方法
废气处理的主要方法七、生物法:利用微生物的生命过程把废气中的气态污染物分解转化成少或甚至无害物质。自然界中存在各种各样的微生物,几乎所有无机的和有机的污染物都能转化;废气处理的主要方法八、直接燃烧法:将有机废气引入燃烧室,直接与火焰接触燃烧,把废气中的可燃成分燃烧分解的一种方法。本...
著名的科学家名字有哪些?
15、汤飞凡(微生物学家,世界上第一个分离出沙眼病毒的人,沙眼病毒被称为“汤氏病毒”) 16、丁颖(著名的农业科学家、教育家、水稻专家,中国现代稻作科学主要奠基人。) 17、梁希(林学家) 18、林巧稚(著名妇产科专家中国科学院第一位女学部委员。) 19、张孝骞(中国科学院学部委员、政协全国委员会常委等职。他...
绿色煤炭的生物转化
此外,还可从生长在暴露于自然界中煤上的微生物中分离菌种。不同微生物与不同煤样的作用有一定的匹配关系,因此,不同煤种溶降解煤的微生物的筛选就显得非常重要。中国的煤种繁多,低阶煤的储量很大,进行菌煤匹配的筛选工作具有重大的实际意义。煤炭生物降解转化的种类已经试验过的煤种有风化褐煤、褐煤,...
脱硫技术的生物脱硫
现在,EBC公司已成为世界上对生物脱硫技术研究最广泛的公司。此外,日本工业技术研究院生命工程工业技术研究所与石油产业活化中心联合开发出了柴油脱硫的新菌种,此菌种可以同时脱除柴油中的二苯并噻吩和苯并噻吩中的硫,而这两种硫化物中的硫是用其它方法难以脱除的[11]。 BDS过程是以自然界产生的有氧细...
微生物接种方法有哪几种?
一、平板划线分离法 平板划线分离法:是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面,通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞,经培养后生长繁殖成单菌落,通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。二、斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察...
微生物与人类关系密切,回答有关微生物及其应用的问题:(1)柴油是一种...
④培养基中没有加入苯酚做碳源,在④中不生长;分离菌种获得单菌落常用的接种方法是稀释涂布平板法或平板划线法;采用固体平板培养细菌时,培养基冷却后形成的水珠滴落在培养基上会污染培养基,所以要将培养皿倒置培养.(3)①为了准确计数需设置对照组,以便确定培养基是否被杂菌污染,若被污染,则计数...
微生物成矿作用
一些非金属矿产如硫、磷的生物成矿作用研究也相继取得了一系列成果,对金属矿床的生物成矿作用研究也正深入开展。微生物可以在许多阶段(如沉积、成岩、构造和变质作用、成矿和风化等)参与作用。但在不同的成矿阶段微生物成矿作用的重要性和表现形式则完全不同。具体到某个特定的矿床的某个成矿阶段,可能是某种生物...
生物选修一考什么啊?
也可以从食醋中分离醋酸菌。 果酒果醋的制作流程:挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒(→醋酸发酵→果醋)四、腐乳制作的原理:菌种:毛霉,真核生物,异养需氧,孢子生殖1、多种微生物参与了豆腐的发酵,如青霉、酵母、曲霉、毛霉等,其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中...
目前脱硫脱硝的方法有哪些,分别是什么?
脱硫脱硝的方法,总结了六种:1)活性炭法 该工艺主体设备是一个类似于超吸附塔的活性炭流化床吸附器,在吸附器内,烟气中的SO2被氧化成SO3并溶于水中,产生稀硫酸气溶胶,随后由活性炭吸附。向吸附塔内注入氨,氨与NOx在活性炭催化还原作用下生成N2,吸附有SO2的活性炭可进入脱附器中加热再生。2)...
尚畏苏诺:[答案] 1、采集土样 2、称取合适量,加水,静置30min 3、取上清液1ml进行梯度稀释 4、取合适梯度涂平板(按照自己要分离的菌选择培养基),每个做3个平行 5、培养,观察,鉴定菌种
桥西区17354624430: 若要通过稀释涂布平板法分离纯化土壤中的微生物,其正确操作步骤是() ①土壤取样; ②称取1g土壤加入盛有99mL无菌水的锥形瓶中,制备10 - 2土壤稀... - ?
尚畏苏诺:[选项] A. ①②③④ B. ①③②④ C. ①②④③ D. ①④②③
桥西区17354624430: 自然界分离微生物的一般操作步骤? - ?
尚畏苏诺: 样品的采取→预处理→培养→菌落的选择 初筛→复筛→性能的鉴定→菌种保藏
桥西区17354624430: 土壤微生物的分离方法 - ?
尚畏苏诺:[答案] 取土壤配好适当浓度的溶液,然后稀释成十的负七次方或者六次方这样. 用微生物接种的方法在酒精灯边上稀释液拿微滴管取500微升置入固体培养基,然后加入玻璃小球摇晃,这是为了让稀释液均匀分布.然后37度培养一天到两天就行了,不能太久...
桥西区17354624430: 微生物分离方法 - ?
尚畏苏诺: 微生物分离法是获得微生物纯培养物的一种分离方法.通过这个方法可实现一种微生物的培养,或获得一个细胞的后代.其具体方法有: 1、稀释倒平皿法.将待分离的材料作一系列稀释,取不同稀释度适量涂布于固体培养基平板上或与已熔化...
桥西区17354624430: 如何从自然界中分离纯化自己想要的目的微生物 - ?
尚畏苏诺: 这个过程叫做“筛选”. 首先确定你所要筛选的目的微生物,并设计好“筛子”.以纤维素酶产生菌的筛选为例. 先找可能存在此类微生物的环境,如森林里的枯枝烂叶和腐质土.采好样品,拿回实验室,首先进行扩大培养.就是把样品中所...
桥西区17354624430: 如何有效地从自然界中提取微生物? - ?
尚畏苏诺: 根据微生物的特性 适当选择正确的选择培养基 培养微生物 根据菌落的形态 就可以分离想要的微生物 比如说 分离尿素分解菌 就可以用尿素做唯一氮源的选择培养基进行培养
桥西区17354624430: 如何从自然界中筛选到一株芽孢微生物 - ?
尚畏苏诺: 关于如何筛选芽孢微生物,很简单,比如从土壤中,把土壤样本放入煮沸的废水中,5分钟后将上清液取样在常用细菌培养基上徒步,装出菌落的,基本上就是芽孢微生物了.关于对一株均的处理机分离纯化,不同类型的目的菌方法会有不一样,楼主问的实在太广,无法回答.要把生产菌和混入杂菌分开,首先楼主自己要对生产菌株的特点非常了解,然后再通过平板划线,挑取单菌落,然后进行相关鉴定试验,从很多杂菌中挑出目的菌株(通常需要挑出10个以上的纯菌落),然后对目的菌种进行培养,从中挑选出生长力旺盛的作为生产菌株.
桥西区17354624430: 从土壤中分离获得某种微生物的步骤是①土壤取样 ②梯度稀释 ③选择培养 ④涂布培养 ⑤筛选菌株 [ - ?
尚畏苏诺: B
桥西区17354624430: 土壤微生物分离计数的方法 - ?
尚畏苏诺: 别费劲了 专家分离 也要做枯燥的试验 我告诉你吧 做不同的培养基,先分离 需氧型和厌氧型,再反复的培养分离不同的菌落. 楼上的方法,土壤都能让你 做成金子 你也分离不完.