自然界分离微生物的一般操作步骤？土样的采取, 预处理, 培养, 菌落的选择产品的鉴定
自然界的微生物，几乎都是混杂在一起的。人们要想观察、研究和利用某一种微生物，就必须将它从各种微生物混生的环境中分离开来。所以微生物的分离是一项十分重要的技术。
一、分离的基本方法
微生物分离的方法很多，主要有连续稀释分离法，平板划线分离法和单细胞分离法等方法。其中，单细胞分离法需要贵重精密仪器，中学无法开展，而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行，中学完全具备开展条件。现将这两种方法说明如下。
1.连续稀释分离法
①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。
②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。
③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。
④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。
⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。
⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。
2.平板划线分离法
①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。
②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。
③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。
④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。
连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。
二、各类微生物的分离
1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌
其分离方法见本节“分离的基本方法”
2.从土壤中分离放线菌
①制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
②称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。振荡10分钟，制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱中，培养7～10天，培养基上会出现微生物菌落。如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
④挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。
3.从土壤中分离霉菌
①制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。将培养皿中，凝成平板，待用。
②称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱内培养3～4天。培养基上会出现微生物菌落。霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。
④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上。
4.从饮水中分离大肠杆菌
①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。
③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。
④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。
⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。
一、微生物工业对菌种的要求
(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。
（二）、微生物工业对菌种的要求是：
（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;
（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;
（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;
（4）能够高效地将原理转化为产品;
（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;
（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;
（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;
（8）具有抗噬菌体的能力；
（9）遗传稳定性，
二、工业用微生物菌种的来源及选育
（一）微生物菌种的来源
一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：
（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；
（2）从大自然中采集样品分离；
（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。
当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
（二）微生物工业菌种的分离
1、野生菌株的分离、筛选过程
（1）新菌种分离与筛选的步骤
菌种分离的流程如下：
标本采集 →标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏
①采样
采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
②标本预处理
④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。
⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定，
⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。
2、菌种的分离方法
（1）施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
（2）随机分离方法
有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。
A、抗生素产生菌的分离
抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。
Ｂ、抗肿瘤药物产生菌的分离
抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。
B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
Ｃ、生长因子产生菌的分离
以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中。
微生物分离的方法很多，主要有连续稀释分离法，平板划线分离法和单细胞分离法等方法。其中，单细胞分离法需要贵重精密仪器，中学无法开展，而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行，中学完全具备开展条件。现将这两种方法说明如下。
1.连续稀释分离法
①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。
②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。
③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。
④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。
⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。
⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。
2.平板划线分离法
①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。
②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。
③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。
④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。
连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。
二、各类微生物的分离
1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌
其分离方法见本节“分离的基本方法”
2.从土壤中分离放线菌
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3.从土壤中分离霉菌
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③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。
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尚畏苏诺：[答案] 1、采集土样 2、称取合适量,加水,静置30min 3、取上清液1ml进行梯度稀释 4、取合适梯度涂平板(按照自己要分离的菌选择培养基),每个做3个平行 5、培养,观察,鉴定菌种
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尚畏苏诺： 根据微生物的特性 适当选择正确的选择培养基 培养微生物 根据菌落的形态 就可以分离想要的微生物 比如说 分离尿素分解菌 就可以用尿素做唯一氮源的选择培养基进行培养
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尚畏苏诺： 关于如何筛选芽孢微生物,很简单,比如从土壤中,把土壤样本放入煮沸的废水中,5分钟后将上清液取样在常用细菌培养基上徒步,装出菌落的,基本上就是芽孢微生物了.关于对一株均的处理机分离纯化,不同类型的目的菌方法会有不一样,楼主问的实在太广,无法回答.要把生产菌和混入杂菌分开,首先楼主自己要对生产菌株的特点非常了解,然后再通过平板划线,挑取单菌落,然后进行相关鉴定试验,从很多杂菌中挑出目的菌株(通常需要挑出10个以上的纯菌落),然后对目的菌种进行培养,从中挑选出生长力旺盛的作为生产菌株.
桥西区17354624430： 从土壤中分离获得某种微生物的步骤是①土壤取样 ②梯度稀释 ③选择培养 ④涂布培养 ⑤筛选菌株 [ - ？
尚畏苏诺： B
桥西区17354624430： 土壤微生物分离计数的方法 - ？
尚畏苏诺： 别费劲了 专家分离 也要做枯燥的试验 我告诉你吧 做不同的培养基,先分离 需氧型和厌氧型,再反复的培养分离不同的菌落. 楼上的方法,土壤都能让你 做成金子 你也分离不完.
