【文献解读】源井基因编辑THP-1细胞助力揭密促炎因子CypA作用机制
由于细胞因子在炎症反应中起着重要作用，为了检测这些细胞因子在炎症模型中的表现情况，作者分别提取了 Ppia -/- 和WT小鼠肺部、支气管肺泡灌洗液（BALF）、血清中的mRNA，通过qPCR、ELISA以及免疫组化实验，分别检测了肺部细胞因子Il1b（图1E），以及BALF（图1F）、血清（图1G）和肺部（图1H和图1I）的分泌细胞因子IL-1β的表达量，发现WT小鼠不同部位中这两个细胞因子在6h、12h、24h时的表达量均高于 Ppia -/- 小鼠，而到3d、5d、7d后的表达量出现了反转。除此以外，作者还检测了其他细胞因子在不同部位的表达量。总而言之，所有实验结果表明，在LPS诱导的炎症小鼠模型中，CypA主要通过调节IL-1β的表达量来控制其在炎症不同阶段中的作用。
为了进一步确定CypA为什么能在炎症早期促进IL-1β的表达，首先查阅文献可知，CypA可以通过调节NF-κB中的p65来促进促炎细胞因子的产生。这里作者选择了经典的小鼠原代细胞系——骨髓来源巨噬细胞（BMDM），人源非小细胞肺癌细胞系A549和炎症研究的人源经典细胞系THP-1 （THP-1/ P PIA -/- 细胞由源井提供） ，通过CRIPR-Cas9、干扰等方法，获得对应的 PPIA 敲除或敲降的突变细胞系。随后，通过LPS对这些WT和突变细胞系进行处理来模拟肺炎，分别在0、2h、4h、6h、8h检测并比较了在小鼠模型中检测过的细胞因子Il1b或IL1B的mRNA表达量（图S2A-C）；又通过免疫印迹，分析了0、4h、8h、12h时CypA、pro-IL-1β的蛋白表达量（图S2D-F），以及0、15min、30min、60min时磷酸化的p65的表达量（图S2G-I）。由此说明，CypA是通过增加p65的磷酸化水平来提高 Il1b 和 IL1B 的表达，以及pro-IL-1β的含量。为了进一步确定CypA是怎么促进IL-1β的表达，作者对CypA的PPIase活性功能域进行了突变（R55A），检测了与PPIA敲除细胞系相同的成分（S2J-L），显示出与PPIA敲除时一致的结果，由此说明，在炎症早期阶段，CypA介导的IL-1β表达的增强需要其酶的活性。
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根据前人研究结果可知，IL-1β最初是作为一种不活跃的促细胞因子（pro-IL-1β）合成的，一旦二级信号被激活，pro-IL-1β则被NLRP3/ASC/caspase-1炎性小体切割成有活性的IL-1β。因此，作者进一步研究了CypA是否对pro-IL-1β的加工具有影响。首先通过在BMDM/ Ppia -/- （图2A）、THP-1/ P PIA -/- （图S3A）、A549/CypA-（图S3B）模型中的ELISA实验可知，当ATP刺激炎症小体激活时，CypA突变型细胞系中IL-1β的表达是显著低于对应WT细胞系的。
（ 2 ） LPS 诱导的炎症消退阶段中， CypA 的抑制作用
有报道指出，在没有如ATP的二级信号的刺激下，IL-1β的加工和释放是低效的，且大多数合成的产物都被留在细胞内，要么不被处理，要么被降解。为了探究CypA为什么能在炎症晚期阶段抑制IL-1β的表达，作者随后研究了CypA对pro-IL-1β稳定性的影响。首先还是利用免疫印迹法，直接检测了BMDM/ Ppia -/- （图2B）、THP-1/ P PIA -/- （图S3C）、293T/CypA-、模型中pro-IL-1β的表达量，结果表明，CypA能加速上述三个WT细胞中内源pro-IL-1β的降解。随后，将带有FLAG标签的pro-IL-1β表达载体转染到293T，并用DMSO、MG132和NH4Cl处理（图2C），比较发现，MG132能促进pro-IL-1β的降解，由此说明pro-IL-1β的降解是由泛素-蛋白酶体途径降解，且这个过程不依赖于CypA的PPIase活性（图S3E）。
（ 3 ） CypA 影响 pro-IL-1 β泛素化
有研究报道，K63连接泛素化的pro-IL-1β对炎性小体的激活和IL-1β的分泌具有重要作用。因此，为了验证CypA是否影响pro-IL-1β的泛素化，作者实施了泛素化实验，通过免疫印迹的方法，在293T和BMDM细胞中发现，在没有ATP刺激下，CypA对pro-IL-1β的K48连接泛素化具有显著影响（图2D、图S3F），但当ATP单独作用时，CypA则逐渐增加pro-IL-1β的K63连接泛素化（图2E、图S3G）。
（ 4 ） pro-IL-1 β关键泛素化位点验证
为了进一步验证pro-IL-1β的关键泛素化位点，通过质谱分析，找到了K73、K132、K143这三个潜在的泛素化位点。免疫印迹实验证明，K73R、K132R和K143R突变导致pro-IL-1β的K48连接泛素化减少，而K132R、K143R突变导致pro-IL-1β的K63连接泛素化减少（图2F）。仍不能确定哪个才是pro-IL-1β加工的关键泛素化位点。于是作者将NLRP3、ASC和caspase-1与pro-IL-1β的野生型或突变型共转染293T细胞，并用ATP刺激，通过免疫印迹（图2G）和ELISA（图2H）实验发现，K143R突变会阻止pro-IL-1β剪切成活性的IL-1β，从而判断K143是pro-IL-1β加工的关键位点。随后再次通过免疫印迹检测转染了编码野生型pro-IL-1b-myc及其不同突变基因载体的293T（图2I），发现K132和K143是pro-IL-1β降解的关键位点。
综上所述，这些数据表明，在炎症激活期，有高浓度ATP的刺激下，CypA主要通过增强K143位点的K63连接泛素化来促进pro-IL-1β的加工；而在炎症缓解期，低浓度ATP环境下，CypA主要通过促进pro-IL-1β在K132和K143位点处K48泛素化来加速pro-IL-1β的降解。
当然，作者的研究不止步于此，后续利用类似的方法，通过精心的实验设计与对比，对IL-1β诱导的炎症模型进行了更加系统的研究，揭示了CypA加剧IL-1β诱导的炎症机制，阐明了CypA在IL-1β诱导的II型上皮间质转化(EMT)肺修复中作用，为未来对与炎症相关疾病的治疗提供了更系统的理论基础，及相关靶点筛选的方向。
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ww黄色。
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