组织培养的具体方法是什么
1.外植体的建立
(1)外植体的选取 组织培养的外植体,一般分为两类:一类是带芽的外植体,如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等,在组织培养过程中可直接诱导促进丛生芽的大量产生,其获得再生植株的成功率较高,变异性也较小,易于保持材料的优良性状。另一类主要为根、叶等营养器官及花药、花瓣、花托、胚珠、果实等生殖器官。这类外植体大都需要一个脱分化过程,经过愈伤组织阶段再分化出芽或产生胚状体然后形成再生植株。
在快速繁殖上,最常用的外植体是茎尖。通常切块在0.5厘米左右,太小,产生愈伤组织的能力较弱;太大,则在培养器皿中占空间太多。如果为培养无病毒苗而采用的外植体,通常仅取茎尖分生组织部分,其长度常在0.1毫米以下。
(2)外植体的消毒 由于外植体大都采用外界生长的植株,常带有各种微生物,如带入培养基,会迅速繁殖而形成污染,导致培养工作的失败。因此,外植体消毒是必不可少的工作,消毒既要杀灭外植体上的病菌,又不能伤害材料而影响其生长。由于材料不同,栽培条件、季节等不同,不同外植体消毒应选用各自合适的消毒剂种类、消毒剂浓度、消毒时间及处理程序。
理想的消毒剂应有较强的杀菌能力,并应具有易去除而不易伤害外植体的特点。常用的有次氯酸钠(0.5%~10%)和漂白粉(1%~10%)滤液,能分解产生具杀菌作用的氯气,并自行散发到空气中,只要浓度得当,一般不会伤害外植体。双氧水(3%~10%)也易分解而不易伤害外植体。酒精(70%)具较强的渗透力和杀菌作用,且易挥发,但会杀死组织细胞,所以消毒时间不宜过长。常用酒精先消毒几秒钟,有利其他消毒剂渗入材料发挥杀菌作用。
消毒方法和程序因材料不同而异。通常先用酒精(70%)浸数秒,取出后置于10%次氯酸钙饱和上清液浸10~20分钟或2%~10%次氯酸钠溶液浸6~15分钟,取出后用无菌水冲洗3次。
2.外植体的增殖
外植体的增殖是组培的关键阶段。接种后的培养容器在培养室中,一般每天光照16小时,1500~3000勒克斯,温度在25℃左右进行分化培养。在新梢等形成后为了扩大繁殖系数,还需要进行继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中,增殖培养基一般在分化培养基上加以改良,以利于增殖率的提高。增殖培养1个月左右后,可视情况进行再增殖,经一次又一次的继代,即可增加植株数量。
继代培养中由于外植体本身来自无菌环境,不需要消毒,操作较方便。但由于继代培养中外植体分化能力会逐渐下降,所以继代培养代数也不是无止境的。
3.根的诱导
继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根,必须转移到生根培养基上进行生根培养。生根培养基较多用1/2MS培养基,因为降低无机盐浓度有利于根分化。此外,生根培养基在激素种类和浓度上与增殖培养基有较大差异,主要如细胞分裂素、生长素等,一般细胞分裂素抑制生根而生长素促进生根。
一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。此外,生产中也有用具根原基试管苗,即只在生根培养基中培养7~10天,诱导根原基或小于1毫米的幼根后即用于移植。由于其基部切口已愈合而形成根原基,不易感染,且栽后能很快生根,具较高的成活率。
4.组培苗的炼苗移栽
生根或形成根原基的试管苗从无菌,光、温、湿稳定环境中进入自然环境,从异养过渡到自养过程,必须经过一个驯化锻炼过程,即所谓炼苗。
一般移植前,先将培养容器打开盖子,于室内自然光照下放3天,然后取出苗,用自来水将根系上琼脂冲洗干净,再栽入已准备好的基质中。基质常用泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等或适当加部分园土,使用前最好用高温或药物消毒。移栽前期要适当遮荫,加强水分管理,保持较高的空气湿度(相对湿度90%左右)。但注意基质不宜过湿,更不能积水,以防烂苗。此外,温度对成活率影响也很大,以15~25℃最适宜,夏季温度过高,水少小苗易萎蔫,水多又易腐烂,管理较困难,成活率下降。炼苗4~6周,新梢开始生长后,小苗即可转入正常管理。
要根据培养目的适当选取材料,选择原则:易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方
面要从健壮的植株上取材料,不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天,最好是中午或下午取
材料,决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织,有自身消
毒作用,这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒
从外界或室内选取的植物材料,
都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带人培养基,
便会造成
培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上。
第一步,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。把材
料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料
清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加
入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的
物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质
—
吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、
70%
酒
精、消毒液、无菌水、手表等。用
70%
酒精浸
10
~
30s
。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,
加之
70%
酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花
蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用
70%
酒精处
理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取
1
—
2
种使用见表。第四步是用无菌
水涮洗,涮洗要每次
3min
左右,视采用的消毒液种类,涮洗
3-l0
次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂
杀伤植物细胞的副作用注意:①酒精渗透性强,幼嫩材料易在酒精中失绿,所以浸泡时间要短,防止酒精
杀死植物细胞。②老熟材料,特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些,如种子可以浸泡
5
分钟。③升
汞的渗透力弱,一般浸泡
10
分钟左右,对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿,所
以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为
0.08
—
0.12%
的吐温
20
或
80
(一种湿润剂),可以
降低植物材料表面的张力,
达到更好的消毒效果。
灭菌剂
使用浓度
(%)
持续时间
(
min
)
去除的难易
效
果
次氯酸钙
9~10 5~30
易
很好
次氯酸钠
2 5~30
易
很好
氯化汞
0.1~1 5~8
较难
最好
抗菌素
4~50mg/L 30~60
中
较好
制备外植体
将已消毒的材料,用无菌刀、剪、镊等,在无菌的环境下,剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等,
叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手触动材料。
接种和培养
(一)接种
在无菌坏境下,将切好的外植体立即接在培养基上,每瓶接种
1
-
2
个,以防止交叉污染。(二)封口
接种后,瓶、管用无菌药棉或盖封口,培养皿用无菌胶带封口。
(三)温度
培养基大多应保持在
25
℃左右,但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。
增殖
外植体的增殖是组培的关键阶段,
在新梢等形成后为了扩大繁殖系数,
需要继代培养。
把材料分株或切
段转入增殖培养基中,增殖培养基一般在分化培养基上加以改良,以利于增殖率的提高。增殖
1
个月左右
后,可视情况进行再增殖。
根的诱导
继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根,
必须转到生根培养基上进行生根培养。
1
个月后即可获得
键壮根系。
组培苗的炼苗移栽
试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境,必须进行炼苗。一般移植前,
先将培养容器打开,于室内自然光照下放
3
天,然后取出小苗,用自来水把根系上的营养基冲洗干净,再
栽入已准备好的基质中,基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫,加强水分管理,保持较高的空气湿度
(相对湿度
98
%左右),但基质不宜过湿,以防烂苗。
组织培养中的清洗、消毒灭菌技术
日期:
2010
年
4
月
1
日
来源:互联网
作者:植物组培网
点击:
2190
1
、
清洗
植物组织培养用的各种玻璃器皿,
特别是培养瓶和盛培养基的器皿,
一定要严格清洗,
以防油污、
重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内,影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗,先将污
物如培养基、培养物倒掉,再浸入水中,然后洗涤。玻璃器皿的洗涤,可根据器皿的污染程度和性质,采
用不同的方法,通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿,必须先进行高压消毒和煮沸,以杀死菌
体,否则会产生孢子飞扬,污染环境,给组织培养带来严重困难。器皿洗净后,应烘干或晾干,放在规定
的地方,便于取用。
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热
(
烘烧和灼烧
)
、湿热
(
常压或高压蒸
煮
)
、射线处理
(
紫外线、超声波、微波
)
、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;化学方法是使用升汞、甲
醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要
根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌(培养基)培养基在制备后的
24h
内完成灭菌工序。高
压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸气不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅
内温度也随之增加。在
o
.
1MPa
的压力下,锅内温度达
121
℃。在此蒸气温度下,可以很快杀死各种细
菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有
几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,
通电后,待压力上升到
O
.
05MPa
时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。三
次放气后,关阀再通电,压力表上升达
0
.
1-0
.
15Mpa
时,维持
15-20min
。
•
对高压灭菌后不变质的
物品,如无菌水、栽培介质、接种用具,可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间,
既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间。对于一些布制品,如实验
服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭菌
20-30min
。高压灭菌前后的培
养基,其
pH
值下降
0.2-0.3
单位。高压后培养基
pH
值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌
前用碱调高
pH
值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭
菌后的
pH
值变化幅度较大,甚至可大于
2
个
pH
值单位。环境
pH
值的变化大于
0.5
单位就有可能产生
明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,
从而改变培养基的渗透压。
在
8%-20%
蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基约升高
0
.
43
倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解,可使
15%-25%
的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于
5.5
,其水解量更多,培养基中添加
0.1%
活性炭
时,高压下蔗糖水解大大增强,添加
1%
活性炭,蔗糖水解率可达
5%
。
灼烧灭菌(用于无菌操作的器械
)
•
在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入
95%
的酒精中,使
用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后,立即使用。操作中可采用
250
或
500ml
的广口瓶,放入
95%
的酒精,以便插入工具。
干热灭菌(玻璃器皿及耐热用具)干热灭菌是利用烘箱加热到
160-180~C
的温度来杀死微生物。由
于在干热条件下,
细菌的营养细胞的抗热性大为提高,
接近芽抱的抗热水平,
通常采用
170
℃持续
90min
来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用
耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温,达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免
妨碍热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭
菌能源消耗太大,浪费时间。
过滤灭菌(不耐热的物质
)一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,
不能用高压灭菌处理,
通常采用过滤灭菌方法。
可用无菌的孔径
0.20-0.45um
的硝酸纤维素膜过滤菌类,
当溶液通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,在需要过滤灭菌的液体量大时,
常使用抽滤装置;液量小时,可用注射器。使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过
滤的液体装入注射器,推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无菌溶液。
紫外线和熏蒸灭菌(空间)
•(1)
紫外线灭菌
在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭
菌是利用辐射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成
死亡。紫外线的波长为
200
—
300nm
,其中以
260nm
的杀菌能力最强,但是由于紫外线的穿透物质的
能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,而且要求距照射物以不超过
1.2m
为宜。
(2)
熏蒸灭菌
用加热焚烧、
氧化等方法,
使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,
以杀死空气和物体表
面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭
紧密,按
5
—
8ml
/
m3
用量,将甲醛置于广口容器中,加
5g/m3
高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预
先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多,它们使微生物
的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。
一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好。另外,由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用,所
以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和
酒精例外
植物用固体培养基(含五大营养物质),动物则为液体…
放养
组织培养是应用无菌操作技术,培养植物的体外器官、组织或细胞,使其在人工控制的条件下进行生长和发育,即分离植物体的一部分,如茎尖、芽尖、根尖、胚芽、叶片、鳞片等,接种在人工配置的培养基上进行培养,利用植物细胞的再生能力,在无菌的适宜条件下,长出不定芽和不定根,使之重新形成一个完整的植株。是一种先进的植物繁殖技术。
组织培养的具体方法是什么
一、培养基配制 配制培养基有两种方法可以选择,一是购买培养基中所有化学药品,按照需要自己配制;二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂,如MS、B5等。 自己配制可以节约费用,但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题,给实验带来麻烦。就目前国内的情况看,大部分还是自己配制。为了方便起见,现...
鸢尾进行组织培养的方法是怎样的?
鸢尾组织培养(以下简称组培)的方法及步骤如下:(1)接种 每年春天当鸢尾开花时,采集鸢尾幼嫩的花序作为组培接种材料,也可在秋天用鸢尾新长出的小芽接种。在超净工作台上剥去外面套叠的叶片或苞片,用75%的酒精消毒30秒,再用0.1%的氯化汞消毒2~3分钟,最后用无菌水冲洗3~4分钟,将有节的部分...
植物组织培养一般方法?
植物组织培养的一般方法包括四个主要阶段:第一阶段,建立无菌操作体系。这一阶段需要对植物材料(外植体)和培养基进行彻底的消毒处理,以确保无微生物污染。通过这种处理,可以获得无菌的愈伤组织或器官。第二阶段,细胞增殖和分化。在这个阶段,愈伤组织会继续分化,产生新的植物细胞或组织。这些细胞或组织...
组织培养怎么做,求步骤,求方法
用不同的方法,通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿,必须先进行高压消毒和煮沸,以杀死菌体,否则会产生孢子飞扬,污染环境,给组织培养带来严重困难。器皿洗净后,应烘干或晾干,放在规定的地方,便于取用。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射...
植物组培是通过哪些方法获得的?
用植物各部分组织,如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株,也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养,愈伤组织再经过再分化形成再生植物。不过这种组织没有发生分化,只是一团薄壁细胞,叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下,愈伤组织便开始分化。
植物组织培养植物组织的培养
非试管微组织快繁技术是一种经济、简便的植物繁殖方法。它利用带一叶一芽的外植体,放置在普通沙子培养基上进行培养。这种培养方法能够利用植物腋芽自然倍增,快速达到繁殖目的。一般情况下,植物在7-15天内就能长出根系。非试管微组织快繁技术投资低,操作环节少,适合于大规模快速繁殖。相比之下,试管...
组织培养的分为哪四个阶段?
在这种情况下可以用切段法,把茎分切成许多段,使每段带有一枚叶片,即一个侧芽,再接种在培养基上,使侧芽萌发、生长、伸长。如此继代培养,加速繁殖。这种做法实际上是在试管内进行微型扦插繁殖。在国内马铃薯和葡萄的快速繁殖(组织培养)就是采用这种方法。在花卉的组织培养快速繁殖中,上述两种方法...
植物组织培养一般方法?
(1)建立无菌体系,即外植体及培养基的消毒、接种,获得愈伤组织或器官。(2)进行增殖,不断分化产生新的植株,或直接产生不定芽及胚状体,也可以根据需要反复进行继代培养,以达到大量繁殖的目的。(3)将植株转移进行生根培养,可以转入生根培养基,也可以直接切取进行扦插生根。(4)试管苗过渡,即...
谁能讲讲植物组织培养的具体步骤
植物组织培养步骤 一、培养材料的采集 组织培养所用的材料非常广泛,可采取根、睫、叶、花、芽和种子的子叶,有时也利用花粉粒和花药,其中根尖不易灭菌,一般很少采用。对于木本花卉来说,阔叶树可在一、二年生的枝条上采集,针叶树种多采种子内的子叶或胚轴,草本植物多采集睫尖。在快速繁殖中,最...
什么叫扦插、嫁接、压条、组织培养?
扦插是从植物上截取茎插入土中,使之长成新个体。嫁接是把一种植物的芽或茎接到另一种植物上,两种植物品种相同或相近,品质不同。压条是把植物体长枝末端压入土内,使之长成新个体。组织培养是取植物体某以组织,放入带有营养液的器皿中培养,长成新个体后取出,根埋入土中。(这些不是概捻)...
蛮明安利: 准备无菌培养基,培养基里要有无机盐,水,糖类,生长素,细胞分裂素,95%的氧气和5%的二氧化碳 1.把植物的茎尖细胞放到培养基里 2经过脱分化到再分化,到再分化时就要放到阳光充足处,然后就让这棵小树苗沐浴在杰科的阳光下慢慢成长了. 唉~~~~甘都唔记得.............
龙泉驿区17348208849: 设计一种植物组织培养的方法一种植物组织培养的方法,越详细越好.分数另给,3Q - ?
蛮明安利:[答案] 一、培养材料的采集 组织培养所用的材料非常广泛,可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶,有时也利用花粉粒和花药,其中根尖不易灭菌,一般很少采用. 对于木本花卉来说,阔叶树可在一、二年生的枝条上采集,针叶树种多采种子内的子叶或...
龙泉驿区17348208849: 植物组织培养类型有哪些呢? - ?
蛮明安利:[答案] (一)按外植体的来源分 外植体:是指在植物组织培养过程中,从植物母体上取来,用于离体培养的初始材料. (1)植株培养 是指对具有完整植株形态的幼苗或较大的植株进行离体培养的方法. (2)胚胎培养 是指对植物成熟或未成熟胚进行离体培...
龙泉驿区17348208849: 组织和培养班集体的要求与方法是什么? - ?
蛮明安利:[答案] 1、确立目标; 2、建立班委会; 3、培养正确的舆论和良好的作用; 4、组织开展班级活动.
龙泉驿区17348208849: 植物细胞和组织培养方法有哪几种 - ?
蛮明安利: 固体培养和液体培养.植物组织培养包括2个过程,脱分化和再分化.1.外植体(被培养的组织块--叶片碎片、茎尖、幼胚等或细胞--去壁的叶肉细胞)细胞恢复分裂,形成大量的细胞--愈伤.这个过程是脱分化.由于是已经成熟的细胞脱离了成熟细胞的状态,回到类似胚胎阶段的状态,故称脱分化.2.愈伤组织的细胞经过诱导,分化形成根、茎、叶等器官甚至形成类似种子中的胚一样的结构--胚状体(体胚),这个过程就是再分化.
龙泉驿区17348208849: 谁能讲讲植物组织培养的具体步骤?
蛮明安利:哪个部分都可以,根块茎部大概比较方便 选用液态培养基 要经常更换培养基 注意消毒,杀菌
龙泉驿区17348208849: 龙胆花组织培养增殖的方法是什么? ?
蛮明安利: 用于增殖的个体少时,可以把新芽的每一个节分 割开来置床.增殖的培养基是用MS基本式添加有BA 2. 0毫升/ 升,NAA 0.02毫升/升.在这种培养基的继续培养中,由...
龙泉驿区17348208849: 草莓繁殖的方法 ?
蛮明安利: 草莓繁殖有四种方法:匍匐茎繁殖,新茎分株繁殖、组织培养繁殖及种子繁殖.1、匍匐茎繁殖法匍匐茎繁殖方法是利用草莓具有发生较多匍匐茎、并在匍匐茎偶数节上可...
龙泉驿区17348208849: 什么是组织培养 - ?
蛮明安利: 组织培养是应用无菌操作技术,培养植物的体外器官、组织或细胞,使其在人工控制的条件下进行生长和发育,即分离植物体的一部分,如茎尖、芽尖、根尖、胚芽、叶片、鳞片等,接种在人工配置的培养基上进行培养,利用植物细胞的再生能力,在无菌的适宜条件下,长出不定芽和不定根,使之重新形成一个完整的植株.是一种先进的植物繁殖技术.