分子杂交技术的几种常见的杂交

分子杂交有什么分法？~

通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合双链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。

核酸杂交技术基本上是Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。典型的反应是用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。该法是研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是：从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液（含0.12mol/L磷酸盐缓冲液或0.18mol/L Na+），经煮沸使dsDNA热变性成 ssDNA。然后冷至约60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。通常该实验可比较不同来源生物DNA的复性速率，并可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。

60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。如Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。RNA在代谢过程中被3H尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定的基因组DNA杂交，继而用RNase处理，消化非特异性结合的RNA。漂洗后计数以测定杂交探针的量。通过计算与已知量DNA杂交的RNA量即可评估rRNA基因数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。

进入70年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如，对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验又有兴趣。固相化的Poly U –Sepharose和寡（dT）-纤维素使人们能从总RNA中分离Poly A+ RNA。用mRNA的经纯化技术可从网织红细胞总RNA中制备α-和β-珠蛋白mRNA混合物。这些珠蛋白mRNA首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。由于制备cDNA探针很繁琐，所获得cDNA的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推广的基础。

70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体DAN载体的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA。迄今为止，已克隆和定性了许多特异DNA探针。

由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18～100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因。特异DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印迹和Northern印迹来测定 ，与以前的技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。

尽管取得了上述重大进展，但分子杂交技术在临床实用中仍存在不少问题，必须提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究：第一，完善非放射性标记探针；第二，靶序列和探针的扩增以及信号的放大；第三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使DNA探针实验做到简便、快速、低廉和安全。

分子杂交（molecularhybridization）确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。
探针：标记方法有多种，常用的为同位素标记法和生物素标记法。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。
杂交技术：目前使用较多的是固相杂交法。此法是先将待测单链核酸样品（如为双链，则须先变性成为单链）结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。通过与电泳法和放射自显影法结合，获得杂交图谱，再进行定性或定量分析。分子杂交方法广泛用于生物化学、分子生物学中作为核酸片段碱基序列的检测与鉴定手段。在医学领域中已用于某些病毒或细菌引起的感染性疾病的诊断。它也可用于基因工程。不同来源蛋白质的亚基结合过程也可称为杂交。
在液相分子杂交中，两种来源的核酸分子都处于溶液中，可以自由运动，其中有一种常是用同位素标记的。从复性动力学数据的分析可探知真核生物基因组结构的大致情况，如各类重复顺序的含量及分布情况等。在固相分子杂交中，一种核酸分子被固定在不溶性的介质上，另一种核酸分子则处在溶液中，两种介质中的核酸分子可以自由接触。常用的介质有硝酸纤维素滤膜、羟基磷灰石柱、琼脂和聚丙烯酰胺凝胶等。早期用琼脂作为固定介质的分子杂交方法曾被用来测定从细菌到人多种生物的DNA的同源程度。


（1）固相杂交
　　将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以最为常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。
（2）液相杂交
　　所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。近几年由于杂交检测技术的不断改进，商业性基因探针诊断盒的实际应用，推动了液相杂交技术的迅速发展。
编辑本段固相膜核酸分子杂交（1）菌落原位杂交
　　（Colonyinsituhybridization）　　
将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA，再烘干固定DNA于膜上，与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
（2）斑点杂交
　　（Dotblotting）
　　该方法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。
（3）Southern印迹杂交
　　（Southernblotting）
　　是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜（尼龙膜也较长用）上，烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（4）Northern印迹杂交
　　（Northernblotting）　　
　　DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为westernblotting。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合，为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。样品胶则进行Northern转印，标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸铵中10min，在水中就可脱色。在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。
（5）组织原位杂交
　　（Tissueinsituhybridization）　　
简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。
　　用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针，探针的长度通常以100～400nt为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探针。

分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：
(1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。
(2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。
根据杂交所用的方法,另外还有斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交等。有3种固相支持体可用于杂交:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman 541滤纸有很高的湿强度,最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。Whatman 541滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点:它更便宜,杂交中更耐用,干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心,杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。
(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:(1)毛细管转移。本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。
1、材料： 待检测的DNA，已标记好的探针。
2、设备： 电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。
3、试剂：
(1)10mg/ml 溴化乙锭（EB）。
(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,过滤除菌后于-20℃储存。
(3)1×BLOTTO:5g脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，储于4℃。
(4)预杂交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鲑鱼精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)杂交溶液:预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。
(6)0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
(8)0.4mol/L NaOH。
(9)变性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纤维素滤膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L柠檬酸钠,用1mol/L HCl调节pH至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀释。
4、操作步骤：
(1) 约50μl体积中酶切10pg-10μg的DNA, 然后在琼脂糖凝胶中电泳12-24小时(包括DNA分子量标准物)。
(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙锭,将凝胶放置其中染色30分钟, 然后照相。
(3) 依次用下列溶液处理凝胶,并轻微摇动: 500ml 0.2mol/L HCl 10分钟, 倾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸处理时间为20分钟)，用水清洗数次,倾去溶液; 500ml变性溶液两次,每次15分钟,倾去溶液; 500ml中和溶液30分钟。如果使用尼龙膜杂交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盘中加20×SSC液,将硝酸纤维素滤膜先用无菌水完全湿透,再用20×SSC浸泡。将硝酸纤维素滤膜一次准确地盖在凝胶上,去除气泡。用浸过20×SSC液的3滤纸盖住滤膜,然后加上干的3滤纸和干纸巾,根据DNA复杂程度转移2-12小时。当使用尼龙膜杂交时，该膜用水浸润一次即可，转移时用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。简单的印迹转移2-3小时,对于基因组印迹,一般需要较长时间的转移。
(5) 去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×SSC中洗5分钟,凉干后在80℃中烘烤2小时。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。
(6) 将滤膜放入含6-10ml预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。在一定温度下(一般为37-42℃)预杂交3-12小时，弃去预杂交液。
(7) 制备同位素标记探针（参见第一节），探针煮沸变性5分钟。
(8) 在杂交液中加入探针,混匀。如步骤（6）将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12小时。
(9) 取出滤膜,依次用下列溶液处理,并轻轻摇动: 在室温下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分钟, 两次。 在杂交温度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分钟, 两次。
(10) 空气干燥硝酸纤维素滤膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可见DNA谱带。对于≥108 cpm/μg从缺口平移所得探针,可很容易地从10μg哺乳DNA中检测到10pg的单拷贝基因。 Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
1、材料：待检测的RNA及制备好的探针。
2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3、试剂：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调pH至7.4，定溶到1L。
(2)其他试剂：与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。
4、操作步骤：
(1)RNA经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。
(2)转移完毕后 ,以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。
(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。
(4) 用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42℃进行,应采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS；若于68℃进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。
(5) 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分·μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。
(6) 用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20分钟,随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分钟。
(7) 用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。
[注意]
(1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟,部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC浸泡凝胶45分钟。然后再转移到滤膜上。
(2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA,杂交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)RNA自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。
(4)含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA分子(>2.3kb)转移的速度和效率。此外，碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/LNaOH，转移结束后(4.5-6.0小时)，尼龙膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室温晾干。
(5)尼龙膜的不足之处是背景较高,用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。
(6)如用中性缓冲液进行RNA转移,转移结束后,将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间,80℃干烤0.5-2小时,或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
1、材料：待检测的细菌平皿，已标记好的探针，硝酸纤维素滤膜等。
2、设备：恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。
3、试剂：
(1)LB固体培养基。
(2)0.5mol/L NaOH。
(3)1mol/L Tris·Cl。
(4)1.5mol/L NaCl。
(5)0.5mol/L Tris·Cl。
(6)预洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(7)预杂交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。
(8)其余试剂：与Southern杂交相同。
4、操作步骤：
1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上：
(1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。
(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
(4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。
(6) 裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。
2. 菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜
(1) 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3分钟。
(2) 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤(1)。
(3) 吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜, 再重复一次该步骤。
(4) 吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30分钟,使滤膜干燥。
(5) 将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80℃干烤2小时,固定DNA。
(6) 将固定在膜上的DNA与32 P标记的探针杂交。
5.杂交
(1) 盛有2×SSC的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上,彻底浸湿5分钟。
(2) 将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。
(3) 用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。
(4) 将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃中,在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68℃，而在50%甲酰胺中杂交时用42℃)下,预杂交1-2小时。
(5) 将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。
(6) 杂交结束后,去除杂交液,立即于室温把滤膜放入大体积(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，同时应避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次,每次1-1.5小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。
(8) 把滤膜放在纸巾上于室温晾干后,把滤膜(编号面朝上)放在一张保鲜膜上,并在保鲜膜上作几个不对称的标记,以使滤膜与放射性自显影片位置对应。
(9) 用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小时。
(10) 底片显影后,在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置,同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸,通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。 斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。
1、材料：待分析的DNA或RNA样品，已标记的探针。
2、设备：狭槽点样器，真空泵，恒温水浴，真空烤箱等。
3、试剂：
（1）100% 甲酰胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纤维素滤膜。
（6）滤纸。
4、操作步骤：
(1) 10μl样品与20μl 100%甲酰胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置于68℃，15分钟后置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH清洗点样器,再用无菌水充分冲洗。将一张经20×SSC浸润的滤纸铺在点样器上,上面再铺上一张经20×SSC浸润1小时的硝酸纤维素滤膜，加盖并夹紧，接通真空泵。
(3) 用10×SSC清洗各样孔。在每一样品中加两倍体积的2×SSC,混合后加样于孔中。外围几个孔中加2μl染料定位,缓慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗两次。继续抽吸5分钟,吸干滤膜。
(4) 取出滤膜,夹在两张滤纸中间, 80℃真空烘干2小时。按上述Southern或Norhtern杂交所述的方法与放射性标记探针杂交。
[注意]
1、在放射自显影时应注意滤膜必须干燥，并覆盖上保鲜膜，否则，滤膜将与X-光片粘在一起，使以后的操作困难。
2、在杂交过程中，整个滤膜应一直是湿润的，不得干涸。
第三节 杂交反应的条件及参数的优化
不同的反应条件对杂交结果的影响如下：
(1) 根据杂交液的体积确定杂交的时间：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。
(2) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时,则在68℃杂交,而在50%甲酰胺溶液中时,则在42℃下杂交。
(3) 选用不同的封闭试剂：如Denhardt's试剂、肝素或一种由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO, 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。与Denhardt's试剂相比, BLOTTO价格便宜,使用方便,同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。一般而言,尼龙膜用Denhardt's试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言,通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。
(4)根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度,许多杂交膜一起反应时,连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。
(5) 在杂交过程中加入其他化合物, 如反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 杂交速度可增加约10倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的粘稠性而使操作困难。因此，除非在滤膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探针的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。
(6) 根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度,如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式（高浓度SSC）, 反之则选用非严紧型洗脱方式（低浓度SSC）。洗脱通常在低于杂交体解链温度12-20℃的条件下进行。解链温度(melting temperature, Tm )是指在双链DNA或RNA分子变性形成分开的单链时光吸收度增加的中点处温度。通常富含G·C碱基对的序列比富含A·T碱基对序列的Tm 温度高。有关Tm的计算方法，请参考第八章。
(7) 根据标记探针的浓度及其比活性,选择不同的杂交条件及检测方法。一般使用新的同位素可获得较强的信号。
(8) 在水溶液中杂交时,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时,应该用具有更强缓冲能力的6×SSPE。
上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。

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