如何从蛋白溶解液中提纯总蛋白

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蛋白质溶液中混有淀粉,如何提纯?混有氯化钠呢?~

  淀粉可以用盐析,向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后,可以降低蛋白质的溶解度,使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析,是物理变化,可复原。
  蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与。一般说,蛋白质约占人体全部质量的18%,最重要的还是其与生命现象有关。
  蛋白质(protein)是生命的物质基础,是有机大分子,是构成细胞的基本有机物,是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%,即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多,性质、功能各异,但都是由20多种氨基酸(Amino acid)按不同比例组合而成的,并在体内不断进行代谢与更新。

细胞破碎后,用缓冲液提取蛋白质,用什么方法能得到蛋
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:

(一)材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。

(三)蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法:

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。

(四)样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

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