请教各位，定量PCR是不是一定要以cDNA作模板,可不可以直接拿总DNA作模板直接做定量？
应该会导致内含子的缺失............转基因的话应该可以。
PCR，尤其是普通PCR，对模板的质量要求并不高。
你自己提取RNA反转录的话，得到大量的cDNA(这里还有一个问题，你用哪种引物做反转录)
买来的cDNA如果是针对你的基因的话，可能做过一定的纯化，
如果你图方便的话，肯定是买的就OK
自己反转录的话效率也很高，cDNA可以稀释10倍，100倍去做PCR都能扩增
具体问题具体讨论。
请教各位,定量PCR是不是一定要以cDNA作模板,可不可以直接拿总DNA作模板...
定量PCR的模版既可以使总DNA，也可以是cDNA，但两种做法的用途不同。如果用总DNA做模版，你检测的就是总DNA的拷贝数。如果以cDNA为模版，你检测的就是某个基因的表达水平。
各位内行,请问定量PCR为什么要用两步法而不是普通的三步法?
因为定量PCR一般扩增的目的片段很短，不超过200bp吧！所以略去了延伸一步，而选择一个比较适中的退火温度（如60度）完成核酸链的扩增，两步法在这里更为适用。
荧光定量PCR(FQ-PCR)的原理和优点是什么
主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针，PCR过程中，具有53外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时，将DNA探针逐个降解，释放出荧 光报告基团，这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系，可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。荧光定量PCR的优点： 1.可进行准确的定量检测。用于基因诊断。 2.定...
关于定量pcr的效率值问题
1、PCR反应体系不是最优体系。尽量不要自己配置反应液，最好用试剂公司配好的MIX。2、PCR模板由阻碍物（比如total RNA）。必须要重新提取模板 3、标准品稀释不准确造成标曲斜率不正确。这个就需要你经常练习手法啦~4、如果上述调整过后还是很低则考虑重新设计引物的问题。最后，我用的仪器不是你那款，...
求半定量PCR的详细步骤 要详细到每一步喔
荧光定量PCR需要采用具有5-3外切酶活性的Taq酶扩增，合成一对普通引物和一条荧光双标记的Taq-Man探针。要准雀体现表达水平，半定量RT-PCR, 荧光定量PCR扩增的循环数比常规少，扩增产物一般都要求处在线性区，如果扩增过程已到达平台区，扩增产物就不能反映基因拷贝数的高低。基因芯片的基本原理和Northern ...
持家基因和目的基因退火温度相差很大,怎么跑定量PCR啊?各位大神帮帮忙...
可以加长引物长度来增加退火温度。第二个，分成两锅跑PCR，轻松就搞定。新手？这个问题本身就不是问题，好多定量引物都是公司设计的，长度啥的都考虑好了，而且定量引物一般很短，PCR长度很短，特异性非常强，退火温度相差不会太大，即使很大，也很有希望能够找到合适温度一起跑能出的。
如何选择绝对定量RT-PCR的数据统计分析方法
根据正态、方差齐、样本量等选择分析方法 我替别人做这类的数据分析蛮多的
乙型肝炎病毒(HBV-DNA)定量实时荧光定量PCR结果3.33E+07最低检测下限5....
你的病毒达到了七次方，说明目前病毒复制非常的活跃，传染性很强，但是通过血液传播
各位前辈,新手求教,我要做血浆中的miRNA差异表达的验证,需要什么试剂...
这两个公司都各自有抽提miRNA的试剂盒、逆转录试剂盒、引物设计、实时荧光定量PCR 的全套产品。设计原理稍微有所不同。个人印象Exiqon在血浆的miR抽提方面比较有经验，而Life Tech在定量PCR方面的Tagman技术比较老牌知名。我实际经验只有使用过Life Tech的miR 反转录与PCR试剂盒。每150个反应的引物与探针就要...
荧光定量PCR引物为什么要跨内含子设计
引物若跨内含子的话，引物仅能以3'端的一小部分结合基因组DNA，这样的话Tm会很低。在较高的退火温度下，引物几乎无法和基因组DNA结合来引发聚合，而主要是与能够完全配对的cDNA结合并引发反应。
牟严赛福：定量PCR的模版既可以使总DNA,也可以是cDNA,但两种做法的用途不同.如果用总DNA做模版,你检测的就是总DNA的拷贝数.如果以cDNA为模版,你检测的就是某个基因的表达水平.
婺源县13923983013： 弱问:做实施定量PCR一定要提RNA来逆转录再做吗?为什么不能直接提DNA做? - ？
牟严赛福：[答案] 看你要做什么了.做基因转录,那只有做cDNA,向楼上说的那样. 如果是做染色体定量,那就是用DNA.比如常见的DNA病毒定量,直接提DNA来做.不过RNA病毒定量就要用cDNA了
婺源县13923983013： 荧光定量PCR一定要用管家基因么?我的细胞5个孔药物浓度分别是 0(0.5%FBS的)、 20uM 、 40uM 、 60uM 、 0(10%FBS的)、 都是双复孔的.那最终加在荧... - ？
牟严赛福：[答案] 管家基因是用来做对照的,它表达量恒定,这样你可以通过比较它和你的基因,做出标准化的数值,所有定量必须带有管家基因才能排除干扰.
婺源县13923983013： 定量PCR为什么要用两步法而不是普通的三步法 - ？
牟严赛福： 你这个结论并不对.两步法,三步法并没有本质区别,信号的读取都是在每一个延长结束后读取.定量PCR一开始的时候也是三步法的.两步法,是因为设计引物的时候把退火温度设为酶的工作温度,而且定量PCR的产物都很短,需要的时候都短,所以两步法更方便.三步法的话,花的时间长,不利于快速实验.
婺源县13923983013： 做荧光定量PCR,前期提取RNA的时候一定要加入DNase I和RNase inhibitor吗? - ？
牟严赛福： 1.其实反转录要求不是很高,所有器具消毒操作带手套口罩就行,没必要加RNaseInhibitor 2.OD260/280实际上反应的是蛋白质杂质的比例,可以间接的反应有没有RNA酶污染,所以这个比值低了有可能是RNA酶污染,也可能是提取...
婺源县13923983013： 请教做定量PCR用DNA做还是RNA做 - ？
牟严赛福： 都可以.如果要检测DNA浓度,就用DNA做模板;如果要检测基因表达水平的RNA浓度,就用RNA的反转产物cDNA做模板.
婺源县13923983013： PCR有全定量和半定量之分吗?二者区别是什么? - ？
牟严赛福： 有,基本是半定量.我们平时做的RT-PCR,可以说是半定量的,还有现在比较流行的real time PCR基本可以说是定量的,其实也并不是非常非常准的,一般的PCR都是后定量,real 是前定量,是检测没一个循环的量故名的来的.一般都是SYBR染色,再准确点的是taqman探针.具体你可以查一下.
婺源县13923983013： 实时定量pcr只能用于rna吗 - ？
牟严赛福： 楼主是说荧光定量PCR吗?一般常用于mRNA的水平检测.其实有时候也可以用于DNA的,比如你的转基因品系相对野生型里面有多拷贝的基因,也可以通过RT-PCR来筛选这种转基因品系.
婺源县13923983013： 半定量PCR之前需要做普通PCR,为什么有些需要做一次 - ？
牟严赛福： 荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料(sybr green)或者和目的DNA片段结合的荧光探针(taqman)...
婺源县13923983013： 荧光定量PCR是否需重复,结果怎样选取 - ？
牟严赛福： 当然要做重复.不过一般都是在96孔PCR板上点3~5个孔做重复就可以了.结果直接取个空计算的平均值即可.
