实时定量pcr引物tm值和溶解曲线横坐标的tm是一回事么?
这个用于Syber Green实时PCR。而使用探针的不需要。
因为Syber Green是非特异性结合，所以如果有非特异性的序列被扩增，也会同样产生信号。在设计引物的时候，可以计算出被扩增序列的Tm。PCR反应完成以后，开始进行解离曲线的测量。一般是对反应产物逐步加温，每增加一度，测信号一次。PCR产物会在温度达到TM时发生解离，荧光信号会一下子消失、如果把温度和荧光信号的变化做一个图，就会看到一开始，荧光信号没有变化，是一个平直的线。达到TM附近是，会有一个比较锐利的峰，说明信号的变化很大，继续加热超过TM，这是双链都打开了。所以信号也不会再有变化，所以又是平直的线。
如果产物都是特异性的，就是我上面说的那样。如果有非特异性产物，就会出现不在TM就出现峰值，或者有矮而胖的峰值等等异常情况出现，这样，那个管子的样本就不能用了。
用2-△△ ct法算的话，应如何算？ 假设检测A基因，CT分别为（这里记住CT越大，表明相对含量越低） 普通组/Test1：28 实验组1/Test2：29 实验组2/Test3：30 这时候要设对照了，假设Test1为对照组（普通组），当然是以普通组为对照 那么，相对含量为。
不一样的，引物的Tm是引物本身的解链温度，软件一般会自动给出。溶解曲线横坐标的Tm是PCR产物的解链温度，所以一般是比引物本身的Tm值大的。不是一回事，引物的Tm值不等与反应时的Tm值。反应时的Tm值测量的应该是整个体系的。
TM是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
Tm可采用下列公式计算：Tm＝2(A+T) + 4(G+C)。
定量PCR技术简介
（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。3.2 检测模式 PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：（1）R Green I 检测模式。温度循环为94—55—72℃三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间...
普通pcr与real time pcr引物有区别吗
普通pcr与real time pcr引物没有区别；荧光定量PCR，其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的，只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西，探针法还需要taqman探针，这个探针的设计是比较有讲究的，并且上面有荧光集团和猝灭基团。聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段...
a与t之间有几个氢键
DNA检测方法：1、PCR（聚合酶链反应）：PCR是一种基于DNA复制的技术，通过将特定的DNA片段复制成大量的副本，使得这些副本可以被检测到。PCR可以分为两种类型：传统PCR和实时荧光定量PCR。传统PCR需要设计引物来特异性地扩增目标DNA片段，而实时荧光定量PCR则可以通过荧光信号来实时监测扩增过程，从而更加准确...
如何稀释实时荧光定量PCR的引物?
9.96nmol\/ (100000nmol\/L)= 0.0000996L= 99.6ul Hence, add 99.6ul Rnase-free ddH2O.对任意PCR引物，正确加水体积应为V(ul)=N (nmol)*10,即浓度为100uM. ie,9.96*10= 99.6ul 注：一般情况下，所有PCR引物的stock concentration都是100uM. 使用时将其稀释十倍为10uM进行PCR反应。...
RT-PCR与时时PCR的原理及引物有什么区别?
RT-PCR和一般的PCR相比原理上没有太多的区别，无非就是在反转时候RNA的定量，不同模板的设定。对引物没有特别的要求，能特异代表目的基因就行。real-time PCR根据原理的不同，引物选择也不同。通常用的是SYBR Green的方法，这种方法引物在RT-PCR的基础上需要注意：1.退火温度同内参；2.片段长度不要...
实时荧光定量pcr两步法与三步法的异同是什么?如何选择使用?比如引物...
异同?我觉得还是看你用的机器和试剂盒吧,主要是那个聚合酶的要求。有的推荐两步法,有的推荐三步法。比如,ABI,roche都推荐两步法,tiangen的推荐三步法。我觉得,如果引物设计时的Tm值如果接近60度(比如用ABI的primer express设计的引物),就直接用两步法;如果Tm值不太符合两步法要求,即60度,还是三步法...
科普讲堂|实时荧光定量PCR检测方法
该项技术可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析，提高了普通PCR技术的特异性和准确性，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。一、常规PCR 利用DNA分子会在体外95°高温时会发生变性解旋变成单链，然后降温到60°C左右时引物会与单链DNA按碱基互补配对原则结合，接着再...
PCR和实时荧光定量PCR这两种有什么区别?
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。（来自百度百科）实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中...
实时荧光定量PCR的原理
就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。服务流程1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；4.DNA\/RNA的抽提、定量、RNA反转录；5.PCR预实验，主要检测引物的...
实时荧光pcr已运行的室温要求
技术流程。一、RNA的提取。二、DNaseI消化样品RNA中的DNA。三、RNA琼脂糖凝胶电泳。四、RNA反转录为cDNA。Real-TimePCR引物设计的要求。Tm=55~65℃。GC=30~80%。PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80~300bp之间都可。引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。
家卷苦碟： TM是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的. Tm可采用下列公式计算:Tm=2(A+T) + 4(G+C).
连山壮族瑶族自治县13476164380： 实时荧光定量PCR的结果该怎样分析? - ？
家卷苦碟： 1、如果有标准曲线,按照标准曲线计算; 2、一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计算; 3、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性; 4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起; 5、看CT值是分析...
连山壮族瑶族自治县13476164380： 求助,荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线 - ？
家卷苦碟： 实时PCR产物的Tm值大小一般会在80deg;上下,所以溶解曲线不必从40deg;开始,可以从65deg;开始进行溶解曲线绘制,另外在产物之前出现的小峰,同时也在阴性对照中出现了,应该是引物二聚体或者是非特异的扩增.
连山壮族瑶族自治县13476164380： 荧光定量PCR中扩增曲线能说明什么问题 - ？
家卷苦碟： 在荧光法定量PCR中溶解曲线直接表示了引物的特异性,如果是单一的峰,那么我们要看的是TM值在哪里,通常情况下都是80---90之间,如果太小那可能扩增出来的不是你想要的片段就是引物二聚体,如果两个峰那就说明出现了非特异性扩增
连山壮族瑶族自治县13476164380： 谁能具体解释一下荧光定量PCR中溶解曲线的意思以及作用? - ？
家卷苦碟：[答案] 用Syber Green方法做完PCR后,用来判断产物是否相对专一.反应结束后,逐渐加温.和Syber Green分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链,就不能在和Syber Green结合.一般每加温一度,读一次信号.当温度到达PCR产物的Tm时,产物解离...
连山壮族瑶族自治县13476164380： 您好,我想问一下荧光定量PCR产物的溶解曲线的Tm值在92度可以吗?是不是在86 - 88度之间最好?谢谢 - ？
家卷苦碟： 这个不是绝对的,只是大多数RT-PCR产物的TM值会落在那个范围内,有些目的片段很长的产物有可能会稍微大一点.这跟目的片段长度有关系.主要看产物是否为单一峰,是否有杂峰.
连山壮族瑶族自治县13476164380： SYBR green PCR溶解曲线有何意义 - ？
家卷苦碟： 作用类似于电泳,但是相对于电泳更灵敏,更清晰一些. 通过溶解曲线可以了解目的产物TM值,是否出现杂峰.一般溶解曲线的结果+电泳的结果和在一起相对比较准确.当然最后片段也可以测序最终确定目的产物.主要的是:根据溶解曲线...
连山壮族瑶族自治县13476164380： 荧光定量PCR引物设计 - ？
家卷苦碟： 完全可以,PCR长度从50bp到数百都可以,不止局限于150-300个碱基对.楼上说的有道理,但是有一点要注意,最好计算一下扩增片段的Tm值,这样做溶解曲线的时候,光有一个峰还不够,而且得到的TM和你计算的Tm相吻合才行.是否在翻译区没有影响.
连山壮族瑶族自治县13476164380： 谁能具体解释一下荧光定量PCR中溶解曲线的意思以及作用? ？
家卷苦碟： 定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而BIOG PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量.因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等.
连山壮族瑶族自治县13476164380： 你好,我想请问你关于real - time PCR 中溶解曲线的横轴和纵轴的意义? - ？
家卷苦碟： 横坐标是温度,每个温度点一个.一般从60到98度 纵坐标是荧光强度的变化值(不是强度本身).一开始加热的时候,虽然荧光强度比较强,但是由于双链没有解离,所以荧光强度保持不变.当加热接近于PCR产物Tm时,双链开始解离,荧光强度变小,机器会比较前后2个温度点的荧光强度,然后把2者的差值标在图上.Tm到达时,有一般双链解离,这时的荧光强度变化最大(峰值).再加热,双链全部解离,所以荧光强度的变化又变小了.你PCR产物大小不一,但是只要有相同或者相近的Tm,峰值就有可能在一个位置上.如果实际测得的峰值和理论计算的吻合,问题不大.如果有差别,说明有非特异性产物,建议不要再用SYBR GREEN方法.
