定量PCR实验后,一般要得到什么样的结果?
1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；
2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算；
3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。
扩展资料：
PVR的循环参数：
1、预变性；
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，加热时间参考试剂说明书。
2、变性步骤；
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
3、引物退火；
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4、引物延伸；
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
5、循环数；
大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸；
在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
参考资料来源：百度百科—实时荧光定量PCR
1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。
3、举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。
4、首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
5、几点注意：必须确定扩增的特异性，只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同），2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2，最好不用Syber Green。
扩展资料：
PCR原理：
1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2、PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
参考资料来源：百度百科--PCR反应
【定义】
定量PCR是PCR的一种。PCR仪目的为了基因扩增。在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。PCR的结果需要借助其他手段来检测。后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。还可以与荧光技术结合，同时在每个扩增过程都能实施监控。
【应用】 ：定量PCR可以得出准确的定量结果，改变了PCR只用作微量物定性测定的历史，并可进行动态检测和病程疗效分析。同时让质控的建立成为可能，以保证结果的准确性。能对基因突变进行分析。
定量PCR可以用来比较模板的数量多少。
比如可以用来对比不同基因的表达情况，或者相同基因在不同时期的表达情况。
确定模板的丰度
定量PCR有绝对定量跟相对定量，绝对定量就是先用已知浓度的质粒浓度梯度（1.00E+07、1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03）制作标准曲线，然后通过做Real-time PCR的CT值计算出其表达量；相对定量是比较管家基因（GAPDH）与目的基因的CT值，得出各标本之间目的基因表达量的多少。
目前实时荧光定量PCR主要用两种方法：染料法和探针法，如果科研资金充足的话，建议选用探针法，其数据比染料法准确。染料法也可以达到定量的目的，而且比较廉价。
PCR过后,做胶回收的目的是什么?
胶回收的目的是得到比较纯的目的基因的条带,以便可以更好地进行下一步实验。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手...
我想问一下荧光定量PCR法用2-△△Ct计算相对定量时结果的标准差是如何...
这个很简单啊。你做了一次实验，得到的样本做了一次PCR，得到了一次的相对定量（设对照组为1）。然后重新做实验，再做PCR，又得到一组，这样至少重复3次，就有3组相对定量了。计算标准差 对照组的标准差：取对照组的平均CT值设为1， 3次试验的CT值根据2-△△Ct计算相对量，可以算出对照组的标准...
反转录产物做定量pcr需要稀释吗
可以稀释,一般反转录的体系在10ul,而定量时需要的反应个数较多,一般包括目的基因和内参基因,甚至会有多个基因需要检测,而且会进行2~3个重复平行试验,所以直接反转体系会不足,可以考虑稀释,由于一般是做相对定量,不会影响结果.
pcr模板量是什么意思?
相反，如果PCR模板量过少，产物数量则会减少而且扩增效率低。因此，正确控制PCR模板量可以确保PCR反应的成功，并且降低偏差风险。为了正确地控制PCR模板量，研究者可以选择使用专业的实验室仪器，如光度计、凝胶电泳等来测试DNA模板的浓度和质量；另一种选择是透过初始RNA模板的数量来计算DNA模板的浓度。一般...
大量pcr一扩增,为什么负对照会有带
模板量有时侯太大，PCR扩增会出不来，降低模板量试试。
荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思
PCR原理中，反应一个循环，PCR产物扩增一倍，即为之前的2倍。……反应N个循环，理论上应为原来的2的N次方。此时，理论的扩增效率是100%，即1。但实际上，由于酶，dNTPs，引物，模板等因素，扩增效率达不到100%。因此，我们就要做标准曲线，看实际的扩增效率是多少，也就是标准曲线的斜率。理论上100%...
荧光定量PCR(一)— 基础介绍
荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或者化学作用过程 荧光淬灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类型 荧光定量PCR技术是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量...
荧光定量化学修饰和抗体的区别
2、应用领域不同：荧光定量化学修饰主要应用于分子生物学实验中，如荧光定量PCR、荧光原位杂交等。而抗体则广泛应用于生物学、医学等领域，如生物药物研究、免疫诊断等。3、检测灵敏度不同：荧光定量化学修饰的检测灵敏度通常较高，可以检测到非常微小的分子量。而抗体的检测灵敏度相对较低，通常需要大量的...
最近做荧光定量PCR实验,浓度梯度之间的CT值相差还不到1,这是什么原因...
理论上一个PCR循环，1份模版变成2份，所以多一个Ct，就说明需要多扩增一个循环才能达到同样的荧光强度，模版量应该只有1\/2。也就是说理想状态下，2倍的梯度稀释应该产生Ct+1的递增。10倍的稀释就是Ct增加（以2为底的log10）。实际扩增中由于引物，模版量，杂质等的影响扩增效率可能达不到甚至超过...
快看,各组学的实验方案,给文章加料!
样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图。实验思路见参考文献[11]。 实验材料 不挥发、极性化、热不稳定及大分子(蛋白、多肽、多聚物等)四、转录组学marker验证实验 1. 表达量验证 qRT-PCR(见基因组学)和Northern blot。 Northern印迹杂交(...
纪芳博帅： 定量PCR有绝对定量跟相对定量,绝对定量就是先用已知浓度的质粒浓度梯度(1.00E+07、1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03)制作标准曲线,然后通过做Real-time PCR的CT值计算出其表达量;相对定量是比较管家基因(GAPDH)与目的基因的CT值,得出各标本之间目的基因表达量的多少.目前实时荧光定量PCR主要用两种方法:染料法和探针法,如果科研资金充足的话,建议选用探针法,其数据比染料法准确.染料法也可以达到定量的目的,而且比较廉价.
汨罗市15792943562： 实时定量PCR的结果分析 - ？
纪芳博帅： Sybergreen可以和所有核酸结合,没有特异性.所以要保证特异性的话,最好用其他的方法.扩增体系中加入模板DNA的体积,比如同时10微升的体系,对照组加1微升DNA,实验组加2微升DNA,则实验组的加样量是对照组的2倍.看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据,CT值一般在35左右就失去参考价值了,平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右
汨罗市15792943562： 实时荧光定量PCR的结果该怎样分析? - ？
纪芳博帅： 1、如果有标准曲线,按照标准曲线计算; 2、一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计算; 3、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性; 4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起; 5、看CT值是分析...
汨罗市15792943562： 做实时定量pcr需要哪些试剂? - ？
纪芳博帅： 1.提取mRNA所需试剂: (1)Trizol,很多公司都有卖的,可以看你们实验室经常购买的公司是哪种,问公司技术员; (2)异丙醇、无水乙醇、氯仿; (3)RNase-free水,或DEPC处理水; 2.逆转录所需试剂: 一般使用现成的逆转录试剂盒,要实时定量PCR专用的.TAKARA公司的DRR036和DRR037就不错. 3.实时定量PCR所需试剂: 使用现成的实时定量PCR试剂盒.TAKARA公司和TOYOBO公司都有很多种,具体的要看你的实验要求,可以咨询对应公司技术员.
汨罗市15792943562： 荧光定量pcr多长时间出结果 - ？
纪芳博帅： 荧光定量我用罗氏的反应速度算是相当快的,在样本处理(提出核酸)后,放在荧光定量PCR仪器上一般需要30分钟~1小时左右.但是如果你的样本比如支原体的含量非常高,可能在没有运行结束已经可以看出结果了,但是如果说5分钟就出结果了,确实太快了点.
汨罗市15792943562： 定量PCR的质量评价 - ？
纪芳博帅： RNA 定量的程序很多, 比较用了Ribogree,Agilent BioAnalyser,spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品.结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据.所以用不同的方法进行定量是不明智的.因此,我们需要...
汨罗市15792943562： 病毒DNA做PCR的问题 - ？
纪芳博帅： 当然病毒的鉴定,多用抗体法.如elasa,免疫沉淀.如果是DNA病毒,直接将病毒裂解(比如煮沸)做模板,进行PCR即可,当然你的PCR引物是病毒特异性的.用试剂盒提dna也可,不过要求比较高,除非你的病毒足够多.
汨罗市15792943562： 为什么质粒和PCR产物需要拿去测序啊 - ？
纪芳博帅： 质粒和PCR产物需要拿去测序有2个目的,一是验证插入序列的DNA序列是否无误.第二是看插入的方向和位置是否正确.如果做定量PCR用到质粒的话,一般是用来做标准曲线的. 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子...
汨罗市15792943562： 经过pcr扩增之后,为什么就能证明基因的表达量的多少 - ？
纪芳博帅： 基因表达水平一般是通过该基因转录的mRNA的多少来衡量的,PCR之后可以通过产量的多寡来判断.但是普通PCR一般只能定性判断基因表达量,实时荧光定量PCR可以通过PCR扩增来定量计算RNA含量(通过比较内参的ct值).所以,传统曲线只能定性判断,实时荧光定量PCR曲线可以定性判断.
