快看,各组学的实验方案,给文章加料!
Suorce: Pubmed
为了方便大家快速理解,我查阅大量资料以文字加图片的形式板块化呈现常见的各组学方案及简明实验步骤,本期分享基因组学、蛋白组学、代谢组学以及转录组学4个组学的标记物检测方法,废话少说,直接上干货。
一、基因组学marker验证实验
1. 基因表达
逆转录定量PCR(qRT-PCR)是在样品量少或者非常珍贵的情况研究基因表达的模式。这种方法主要的优点是范围宽、敏感性高、精确度高,无PCR后处理步骤,避免了交叉污染,且产出率高,可以进行多重检测等。具体是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中,引入一个荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比增强。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量变化,最终得到一条荧光扩增曲线。实验思路见参考文献[1]。
实验材料
新鲜、冰冻的组织、细胞,新鲜、冷冻的血液或血浆等
基因表达量的检测方法还包括:PCR[2]、RT-PCR[3]。
2. 甲基化 检测
甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)是一种灵敏度高,且不受限制酶限制的DNA甲基化检测技术。通常是设计两对引物,一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板,另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段,则说明该检测位点存在甲基化,若第二对引物能扩增出片段,则说明该检测位点不存在甲基化。实验思路见参考文献[4]。
实验材料
新鲜、冷冻、石蜡包埋细胞或组织等
甲基化检测的其他技术还包括:亚硫酸氢盐处理+测序[5]、联合硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)[6]等。
二、蛋白组学marker验证实验
蛋白质印迹法(免疫印迹试验,Western blot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。实验方法应用广泛,是常见的蛋白定性及定量检测方法。实验思路见参考文献[7]。
实验材料
新鲜、冷冻的细胞或者组织
酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。基本原理:使抗原或抗体结合到固相载体表面,并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。实验思路见参考文献[8]。
实验材料
新鲜、冷冻的细胞或者组织
免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。是应用免疫学及组织化学原理,对组织切片中的蛋白水平检测。其是采用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测,检测相应的目的抗原(或抗体),并进行定位、定性和定量分析。根据标记物的性质检测技术分为:免疫荧光技术、免疫酶技术、免疫金属技术和放射免疫自影法。实验中应用较多的为免疫荧光技术和免疫酶技术。实验思路见参考文献[9]。
实验材料
石蜡包埋的组织、细胞标本以及冰冻组织切片
三、代谢组学marker验证实验
气相色谱质谱联用(GC-MS):气相色谱法是利用不同物质在固定相和流动相中的分配系数不同,使不同化合物从色谱柱流出的时间不同,达到分离化合物的目的。质谱法是利用带电粒子在磁场或电场中的运动规律,按其质荷比(m/z)实现分离分析,测定离子质量及强度分布,可以给出化合物的分子量、元素组成、分子式和分子结构信息,具有定性专属性、灵敏性高级检测快速等特点。实验思路见参考文献[10]。
实验材料
小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物
液相色谱质谱联用(LC-MS):具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高。其是以液相色谱作为分离系统,质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图。实验思路见参考文献[11]。
实验材料
不挥发、极性化、热不稳定及大分子(蛋白、多肽、多聚物等)
四、转录组学marker验证实验
1. 表达量验证
qRT-PCR(见基因组学)和Northern blot。
Northern印迹杂交(Northern blot)是用于检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及对其进行定量。原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其他标志物标记的RNA探针进行反应。应用的文献较少,实验思路见参考文献[12]。
实验 材料
总RNA样品或mRNA样本(RNA容易降解,需要注意保存方法及周期)
灵敏度:qRT-PCR>Northern blot,特异性:Nortern blot>qRT-PCR(上述已说明实验方案)。
2. RNA和蛋白质相互作用
RNA免疫沉淀(RIP):是将所关注的RNA结合蛋白(RBP)与其结合的RNA一起进行免疫沉淀,鉴定结合转录RNA。可以通过RT-PCR、微阵列或测序检测,是一种基于抗体,用于定位体内的RNA-蛋白质相互作用的技术。实验思路见参考文献[13]。
实验材料
细胞
RNA-pull down:是将RNA进行标记(如生物探针标记)再与胞浆蛋白提取液共同孵育,从而形成RNA-蛋白质复合物,通过SDS-PAGE分离蛋白质,最后通过Western blot或质谱检测蛋白质。用于寻找与目的RNA结合的蛋白。实验思路见参考文献[14]。
实验材料
细胞胞浆蛋白
此外还包括:甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)[13]。
今天的分享就到这里,由于各组学marker验证的方法繁多,本期主要分享常见的方案,期望大家对各组学marker的实验方法有一个简单的认识,基于各组学的后续机制相关探究,还需要加入如细胞功能学实验的细胞增殖、细胞迁移、侵袭、细胞凋亡实验以及动物模型等,这些机制探究的方法大多大同小异,相信大家在阅读相关的文献后很快会发现个中规律~
最后祝大家SCI逢稿必中!
参考文献
1. Liu X, Wang J, Chen M, Liu S, Yu X, Wen F. Combining data from TCGA and GEO databases and reverse transcription quantitative PCR validation to identify gene prognostic markers in lung cancer. Onco Targets Ther. 2019;12:709‐720. Published 2019 Jan 21. doi:10.2147/OTT.S183944
2. Rodriguez, Rebecca M et al. “The landscape of bacterial presence in tumor and adjacent normal tissue across 9 major cancer types using TCGA exome sequencing.” Computational and structural biotechnology journal vol. 18 631-641. 13 Mar. 2020, doi:10.1016/j.csbj.2020.03.003
3. Zhou F, Liu X, Zuo D, et al. HIV-1 Nef-induced lncRNA AK006025 regulates CXCL9/10/11 cluster gene expression in astrocytes through interaction with CBP/P300. J Neuroinflammation. 2018;15(1):303. Published 2018 Oct 31. doi:10.1186/s12974-018-1343-x
4. Xie K, Zhang K, Kong J, et al. Cancer-testis gene PIWIL1 promotes cell proliferation, migration, and invasion in lung adenocarcinoma. Cancer Med. 2018;7(1):157‐166. doi:10.1002/cam4.1248
5. Hu H, Chen X, Zhou C, et al. Aberrant methylation of mutL homolog 1 is associated with increased risk of non-small cell lung cancer. J Clin Lab Anal. 2018;32(5):e22370. doi:10.1002/jcla.22370
6. Pangeni, Rajendra P et al. “The GALNT9, BNC1 and CCDC8 genes are frequently epigenetically dysregulated in breast tumours that metastasise to the brain.” Clinical epigenetics vol. 7,1 57. 27 May. 2015, doi:10.1186/s13148-015-0089-x
7. Han D, Yu T, Dong N, Wang B, Sun F, Jiang D. Napabucasin, a novel STAT3 inhibitor suppresses proliferation, invasion and stemness of glioblastoma cells. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):289. Published 2019 Jul 5. doi:10.1186/s13046-019-1289-6
8. Wang D, Yuan W, Wang Y, et al. Serum CCL20 combined with IL-17A as early diagnostic and prognostic biomarkers for human colorectal cancer. J Transl Med. 2019;17(1):253. Published 2019 Aug 6. doi:10.1186/s12967-019-2008-y
9. Liu L, Liu X, Dong Z, et al. N6-methyladenosine-related Genomic Targets are Altered in Breast Cancer Tissue and Associated with Poor Survival. J Cancer. 2019;10(22):5447‐5459. Published 2019 Aug 29. doi:10.7150/jca.35053
10. Chen H, Pan D, Yang Z, Li L. Integrated analysis and knockdown of RAB23 indicate the role of RAB23 in gastric adenocarcinoma. Ann Transl Med. 2019;7(23):745. doi:10.21037/atm.2019.11.130
11. Apaya MK, Shiau JY, Liao GS, et al. Integrated omics-based pathway analyses uncover CYP epoxygenase-associated networks as theranostic targets for metastatic triple negative breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):187. Published 2019 May 9. doi:10.1186/s13046-019-1187-y
12. Wang XL, Shi WP, Shi HC, et al. Knockdown of TRIM65 inhibits lung cancer cell proliferation, migration and invasion: A therapeutic target in human lung cancer. Oncotarget. 2016;7(49):81527‐81540. doi:10.18632/oncotarget.13131
13. Chen Y, Peng C, Chen J, et al. WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1. Mol Cancer. 2019;18(1):127. Published 2019 Aug 22. doi:10.1186/s12943-019-1053-8
14. Liao M, Liao W, Xu N, et al. LncRNA EPB41L4A-AS1 regulates glycolysis and glutaminolysis by mediating nucleolar translocation of HDAC2. EBioMedicine. 2019;41:200‐213. doi:10.1016/j.ebiom.2019.01.035
15. 高通量测序后的实验验证手段——转录组篇(上)
送你“科研一条龙!实验设计+实验方法+作图一个都不落!
在医学科研探索中,实验设计是每项研究的起点,包括样本分组策略、样本量估算、以及控制无关变量等关键步骤。对照实验、随机化和重复是设计实验时不可或缺的原则。实验方案一旦确定,下一步便是细致入微的Western blot实验技术实践,尽管其操作复杂且技术要求高,但它在分子生物学、克隆、蛋白表达和组学等...
代谢组学究竟是一门什么样的研究方向?
代谢组处于基因调控网络和蛋白质作用网络的下游,所提供的是生物学的终端信息。如同我们在长江的上游建大坝或对江水改道,这些项目的生态影响会在下游的河道和地域体现出来一样,我们经常说,基因组学和蛋白组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什么....
多组学分析是什么
2、多组学研究的缺点 多组学研究需要整合多个不同层次、不同类型的生物信息,研究工作量较大,时间和经费成本相对较高。同时,由于不同类型的数据集来自于不同的研究实验,存在数据共享和整合的问题。3、多组学研究的现状 多组学研究在生命科学领域已经有了广泛的应用,特别是在疾病诊断和治疗方面。近年来...
谁帮我设计两个基因组学实验
先做这个吧,这是很多大学生要求做的内容,原理比较简单,主要就是以下步骤:rtpcr引物上没有设计酶切位点--连T载体--测序--选T载体上的酶切位点双酶切转酵母---酵母阳性克窿鉴定(菌落PCR及提质粒转大肠杆菌)---挑一个经鉴定的酵母阳性克窿保存---诱导表达---SDS-PAGE 实验室的条件就可以...
北大人民医院申占龙团队:抓住乙酰化热点,利用多组学分析联合三种公共数 ...
北大人民医院申占龙团队在乙酰化这一生物化学热点领域取得显著成就。他们利用多组学分析,结合TCGA、ENA和GEO三种公共数据库的数据,以及转录组自测序、单细胞测序等多种实验手段,进行了深入研究。他们的工作涉及了胃癌这一重大疾病,通过HDAC评分(HDS)模型评估胃癌微环境,并揭示了HDACs在不同表达亚型中的...
生物化学实验都有哪些
仪器体积、重量、形状有各种各样,最小的可以直接拿在手中操作,较大体积的仪器一般被称为装置或设备。问题六:生物化学与分子生物学最常用的实验技术包括什么 分子细胞生物学研究所用的实验技术有哪些 分子诊断学的研究范畴包括:利用遗传学、病理学、免疫学、生物化学、基因组学、蛋白质组学和分子生物...
如何学习结构蛋白组学?
结构蛋白组学是研究蛋白质三维结构的科学,它对于理解蛋白质的功能和设计药物非常重要。以下是学习结构蛋白组学的一些步骤:1.基础知识:首先,你需要对生物学、化学和物理学有一定的了解,特别是蛋白质的结构和功能。你可以通过阅读教科书或参加相关课程来获取这些知识。2.学习实验技术:结构蛋白组学涉及到...
北大人民医院申占龙团队:抓住乙酰化热点,利用多组学分析联合三种公共数 ...
他们利用多组学分析,结合TCGA、ENA和GEO等三种公共数据库的强大数据资源,对组蛋白乙酰化进行了详尽研究。首先,他们收集并分析了多个数据集,揭示了蛋白质乙酰化在不同生物学情境下的复杂性。接着,通过转录组测序和单细胞测序,他们确保了生物信息学分析的准确性和可靠性,实验验证了理论推断的实证基础。
蛋白质组学国家重点实验室(中国人民解放军军事医学科学院)的规模化预...
近来,人们发展了许多高通量的实验方法,并以此发现、建立了越来越多的蛋白质相互作用网络。但是,现有的蛋白质相互作用网络只能反映蛋白质之间存在连接关系,而真实生命体系中大部分的蛋白质相互作用具有信号转导、转录激活\/抑制等明显的信号流方向性。准确、高效、大规模预测蛋白质相互作用网络中相互作用的...
怎么研究生物学
实验方法则是人为地干预、控制所研究的对象,并通过这种干预和控制所造成的效应来研究对象的某种属性。实验的方法是自然科学研究中最重要的方法之一。17世纪前后生物学中出现了最早的一批生物学实验,如英国生理学家W.哈维关于血液循环的实验,J.B.van黑尔蒙特关于柳树生长的实验等。然而在那时,生物学的...
夙矿百亿: 1.萘沸点218(以下省略摄氏度),苯甲酸沸点249,乙酸乙酯沸点77 先蒸馏出乙酸乙酯;萘和苯甲酸的混合物中加入氢氧化钠水溶液,分层后分液,萘在下层;水层用强酸酸化后结晶得到苯甲酸 2.苯酚沸点182 先蒸馏出乙酸乙酯;萘和苯酚的混合物中加入氢氧化钠水溶液,分层后分液,萘在下层;水层用强酸酸化后结晶得到苯酚 3.苯胺沸点184 先蒸馏出乙酸乙酯;萘和苯胺的混合物中加入稀硫酸,分层后分液,萘在下层;水层用强碱处理后结晶得到苯酚
华容县13957581781: 五年级研究美丽的彩虹的实验方案怎么写 - ?
夙矿百亿: 一、 做好充分的课前准备工作.这节课,我利用教材的2部分内容:第一部分自制水棱镜.第二部分:制作牛顿盘.要求学生事先做好准备工作:自备小镜子、白色卡纸片、7张彩色卡纸、剪刀、铅笔.老师事先准备好:三棱镜、水槽、喷雾器...
华容县13957581781: 分析化学氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钠混合液各组分含量的测定实验方案的设计 - ?
夙矿百亿: 1,先称取一定量的混合物m,2,把固体溶解3,用准确浓度的盐酸滴定混合液,酚酞做指示剂,酚酞变为微红时,碳酸钠反应刚好生成碳酸氢钠.根据盐酸用量可以算的碳酸钠的量.4,在反应液中再加入甲基橙指示剂,继续用盐酸滴定,甲基橙变色时,混合物重的碳酸氢钠和生成的碳酸氢钠完全反应,根据盐酸用量,可算得原混合物中的碳酸氢钠的量.5,最后可算得氯化钠的量
华容县13957581781: 大学有机化学实验设计,各组分分离提纯实验室现有三组混合物,组成如下:1. 萘、乙酸乙酯、苯甲酸2. 萘、乙酸乙酯、苯酚3. 萘、乙酸乙酯、苯胺设计实验... - ?
夙矿百亿:[答案] 1.萘沸点218(以下省略摄氏度),苯甲酸沸点249,乙酸乙酯沸点77先蒸馏出乙酸乙酯;萘和苯甲酸的混合物中加入氢氧化钠水溶液,分层后分液,萘在下层;水层用强酸酸化后结晶得到苯甲酸2.苯酚沸点182先蒸馏出乙酸乙酯...
华容县13957581781: 分析化学实验方案?
夙矿百亿: ««以下方案可以测定混合物中氯化氢、氯化镁、氯化铁中各组分含量 ««1、取一份溶液,加入适量的pH=2的氯乙酸-醋酸铵缓冲溶液,加入磺基水杨酸作指示剂,加热到70度,用EDTA标准溶液滴定至溶液由酒红色变为无色即为终点,根据消耗...
华容县13957581781: 硫酸 - 草酸混合液中各组分的测定(设计实验)?
夙矿百亿:加如BaCl2,和稀HNO3,测BaSO4沉淀的质量,就可以算出硫酸的质量
华容县13957581781: 磷酸一氢盐和磷酸二氢盐混合液各组分含量测定实验设计?
夙矿百亿: 采用酸碱滴定,终点分别为纯磷酸一氢盐和纯磷酸二氢盐的水溶液PH值.
华容县13957581781: 分析化学实验中,盐酸和氯化铵混合液中各组分浓度的测定?如何进行实验方案设计??
夙矿百亿: 先用NaOH标准溶液滴定至酚酞指示剂显微粉色,测定盐酸含量.再加KI指示剂,用AgNO3标准溶液滴定至出现淡黄色AgI沉淀,这是氯离子总量,差减法求出氯化铵的量.
华容县13957581781: NH3 - NH4CL混合液中各组分浓度的测定实验设计方案、 - ?
夙矿百亿: 测定Cl-(利用AgCl沉淀的方法) 测定NH3总量(加入过量水NaOH,加热,用硫酸吸收NH3测定.)
华容县13957581781: 氧气浓度对植物光合作用的影响请给我详细的实验方案,包括实验材料,注意事项等. - ?
夙矿百亿:[答案] 材料:健康、发育状况及各项生理指标相似的绿色植物若干株,氧气罩11个. 方案(控制变量法): 1.将植物均分为11组,每组3-4株,全部做饥饿处理(放置于黑暗中24小时),处理后依次称重并记录. 2.将各组植物放入气罩,气罩编号A-K,控制A...