10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达原理与应用
作者&投稿：邗迹 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
一、 10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达技术原理
为同时获得同一细胞的转录组和表观组，10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达技术首先利用Tn5转座酶对细胞核悬液进行核DNA转座，Tn5转座酶优先切割开放染色质区域中的核DNA。然后利用Chromium平台进行单细胞基因表达（GEX）和ATAC文库制备，该过程将单个细胞核、反应试剂与单个凝胶珠（Gel Bead）包裹成液滴（GEM）。凝胶珠同时包括带有特异性条形码（10x Barcode）、唯一分子标识符（UMI）的poly(dT)序列和带有10x Barcode的Spacer序列，poly(dT)序列能够捕获具有poly(dA)尾的mRNA用于生成基因表达（GEX）文库，Spacer序列能够将条形码添加到转座的DNA片段上生成ATAC文库。对得到的两种文库进行测序，并将来自同一细胞两种文库的测序数据通过10x Barcode匹配，即可实现同时对同一细胞的转录组和表观组进行关联。
二、 10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达技术优势
1.一个细胞，两种解读
10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达技术可以充分利用样品，从一个细胞中得到转录组和表观组两种信息，可以最大限度地获取有限样品的多层见解。
美国斯坦福大学医学院利用10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达技术从来自同一患者的结直肠癌细胞系COLO320-DM（癌基因 MYC 在ecDNA上扩增）和COLO320-HSR（癌基因 MYC 在串联染色体扩增子（HSRs）上扩增）的总共72,049个细胞中获得了配对的转录组和染色质可及性图谱。单细胞ATAC-seq和单细胞RNA-seq数据的细胞聚类显示了COLO320-DM和COLO320-HSR细胞系的独立聚类。相对于染色体HSR MYC 扩增的COLO320-HSR，在ecDNA MYC 扩增的COLO320-DM中RNA表达以及 MYC 的可及性评分是高度异质性的，表明调控元件的可变活性可以解释细胞间致癌基因表达的差异。
2. 两种聚类结果结合更精细鉴定细胞类型
10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达技术能够同时利用转录组和表观组两套数据数据进行细胞聚类，更好的表征复杂细胞群的细胞异质性，发现隐藏的见解。此外，利用基因表达标记能够更容易地解释表观遗传特征。
麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的研究人员利用单细胞多组学ATAC+基因表达技术获得了来自成年小鼠皮肤34,774个细胞的高质量表观基因组和转录组图谱，基于这两种数据的分析发现，不仅可以区分不同谱系的细胞类型，还可以区分密切相关类型的细胞，例如αhigh CD 34+与αlow CD 34+。基于RNA的的细胞簇也可以通过染色质可及性特征来区分，进一步确认它们的身份，例如根据谱系决定因子的活性对聚类进行了注释揭示了全转录激活因子Dlx3和Sox9以及阻遏物Zeb1和Sox5等。一些细胞状态可以通过染色质或基因表达特征以更高的分辨率识别，例如根据聚类特征对细胞簇进行分组揭示了毛囊永久部分和再生部分之间更明显的染色质可及性差异；相反对应颗粒层的细胞在基因表达水平上作为一个独特的簇更容易区分。
3. 转录组和表观组关联发现新的基因调控作用
10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达技术能够将调控元件与基因表达结合起来，探索驱动细胞分化，发育和疾病的基因调控相互作用。
华盛顿大学的研究人员将单细胞多组学ATAC+基因表达技术应用于8周龄雄性小鼠的肾脏组织，获得了11,296个细胞的转录组和染色质可及性图谱，并发现了1260个远端位点与321个基因的关联。44%的位点关联到最近的TSS，21%则关联到第二近的TSS。相关性最高的关联在远曲小管细胞标记基因 Slc12a3 和其TSS下游36 kb的位点之间，并与其最后一个外显子重叠，该位点的可及性对远曲小管细胞的特异性稍高。远端顺式调控元件和它们的靶基因之间的联系对于解释不同细胞类型的差异表达是有用的。例如， Slc6a 18 （2型近端小管S3细胞的标志基因）的细胞类型特异性表达并不通过细胞类型特异性启动子可及性来反映，它的TSS与16 kb以外的一个位点相关，该位点的可及性与 Slc6a18 表达相关。
三、 10x Genomics单细胞多组学ATAC+基因表达应用领域
由于单一组学的局限性，单细胞ATAC-seq测序技术出现之后不久，单细胞ATAC-seq与单细胞RNA-seq两种技术同时应用的策略便被采用。目前，这种策略已经已被大量应用于器官发育、疾病和癌症发生机制研究等不同领域，累计发表文章将近50篇。而直接利用单细胞多组学ATAC+基因表达技术进行同一细胞转录组和表观组的方法也已被应用于新生和成年小鼠大脑皮层、塞米松治疗的肺癌细胞、小鼠肾脏、小鼠胚胎发育阶段的前脑和小鼠皮肤等组织。2020年12月，首个利用10x Genomics单细胞ATAC+基因表达技术研究ecDNA中枢驱动分子间协同癌基因表达的研究也被报道。
1. 案例：单细胞多组学ATAC+基因表达分析揭示小鼠皮肤谱系决定机制
发表时间：2020年11月
发表单位：麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所等
发表期刊：Cell
影响因子：38.637
1） 研究背景
细胞分化和功能在基因调控的多个层面上受到调控，包括通过染色质可及性的变化来调控基因表达。然而，分化是一个异步过程，妨碍了现在对导致细胞命运决定调控事件的理解。
2） 材料方法
单细胞多组学ATAC+基因表达技术（SHARE-seq），小鼠皮肤、肺和脑组织。
3） 研究结果
a. 多组学分析不仅可以区分不同谱系的细胞类型，还可以区分密切相关类型的细胞；基于RNA的细胞簇也可以通过染色质可及性特征进一步确认身份；一些细胞状态可以通过染色质或基因表达特征以更高的分辨率识别。
b. 在成年小鼠皮肤中鉴定出63,110个peak-gene关联，少数单个峰与4个或更多基因相关。高peak-gene相关的调控染色质区域（DORC）与超级增强子重叠。
c. DORC与已知的跨谱系决定关键调控基因强烈富集。即使在密切相关的细胞群之间DORCs也存在显著差异，表明DORCs具有高度的细胞类型特异性。
d. DORCs通常在其相关基因表达开始前变得可及，这与谱系启动一致。增强子激活预示靶基因表达的长期假设，并暗示染色质可及性是谱系启动的标志。
e. 染色质可及性的全基因组变化反映了谱系启动的细胞状态，染色质潜力可能在比RNA速度更大的时间尺度上预测未来的细胞状态，特别是在分化期间。
参考文献：
1. King L. Hung, Kathryn E. Yost,Liangqi Xie, et al. EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.[J].bioRxiv, 2020.11.19.390278.
2. Ma Sai, Zhang Bing, LaFaveLindsay M et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and chromatin.[J] .Cell, 2020, 183: 1103-1116.e20.
3. Cao Junyue, Cusanovich DarrenA, Ramani Vijay et al. Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells.[J] .Science, 2018, 361: 1380-1385.
希滢岳源： 要看情况,总体的测序深度是否够高,如果某个基因或转录本的reads数目仅有1-2条,我们一般认为其确实存在,但是表达量无法准确估计.所以在下结论的时候一般以readscount;1的认为有表达,但是以FPKM;1为可信的表达量,低于该值的表达量可能是不
疏附县13251723800： 如何同时对单细胞进行多组学研究 - ？
希滢岳源： 单细胞生物与多细胞生物的区分界限是细胞是否发生了分化.多细胞生物的细胞出现了分化,每个细胞行使不同的功能,如有些负责捕食,有些负责消化,有些负责繁殖,等等.单细胞生物与多细胞生物的中间过渡状态是单细胞生物群体.即很多个单细胞生物聚集在一起,共同生活.单细胞生物群体与多细胞生物的区别在于,单细胞生物群体的细胞没有出现分化,所有细胞的功能都是独立的、完整的.举几个单细胞生物群体的例子:细菌会聚集在一起形成菌落,这是最简单的单细胞群体形式了.复杂一点的像粘菌,大量粘菌可以聚集在一起,一定程度上表现出多细胞生物的特征.
疏附县13251723800： 单细胞多核微生物?？
希滢岳源： 楼上答非所问. 所谓单细胞多核生物,就是指细胞质并没有划分,但具有多个细胞核.也可称为合胞体.单细胞是指细胞质为一个统一的、没有被细胞膜划分的一个细胞体.核的数目并不代表细胞的数目.
疏附县13251723800： 单细胞生物和多细胞生物的区别 - ？
希滢岳源： 单细胞生物 :只有一个细胞组成 经常会聚集成为细胞集落 构成十分简单 多细胞生物 :多个、分化的细胞组成的生物体 结构复杂 单细胞生物只会作一些最基本行为 如进食他们的神经系统很简单 且不具备其他系统受到刺激的反应很单一而且单细胞生物形体很小环境适应能力一般很差(菌类除外)以分裂方式繁殖 细胞功能很全面 相对多细胞生物结构很复杂 细胞一般只具有单一功能 行为复杂 环境适应能力强 繁殖方式多种多样.
疏附县13251723800： 体检说单核细胞百分比偏高？
希滢岳源： 单核细胞增多,正常儿童较成人高9%,新生儿达15%.病理性增多(1)某些感染如亚急性感染性心内膜炎、疟疾、黑热病、急性感染的恢复期、活动性肺结核(2)某些血液病单核细胞白血病、粒细胞缺乏症的恢复期、恶性组织细胞病、淋巴瘤及骨髓异常综合征等.减少无意义 只要身体正常,这几项意义较小,不要紧张
疏附县13251723800： 如何区分一种生物是单细胞还是多细胞?？
希滢岳源： 看细胞之间有没有间隔吧,再有就是看细胞核的数目了 植物看有没有细胞壁.简单问题 不能具体了..
疏附县13251723800： 原核生物,真核多细胞,单细胞的共同点与不同点 - ？
希滢岳源： 共同点:都具有基本的细胞结构.不同点:1、原核细胞没有成形的细胞核,而真核细胞有成形的细胞核,这是本质上的不同.2、单细胞生物就是只有一个细胞构成,而多细胞生物则是由多个细胞共同组成,单细胞能够进行的生命活动很少,而多细胞生物则可以进行很多生物活动.
