什么是点种法

菌种选育中复筛的两种方法夹层法和点种法的方法步骤？~

生长谱测定的方法
将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5-6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。一个平皿测一个菌。
以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在5－6个平皿上可测20株菌以上。
筛选结构类似物抗性突变株
结构类似物：结构与代谢产物类似的化合物
特点：有反馈调节作用
无正常生理功能
筛选方法：浓度梯度法（补充）
黄色短杆菌的代谢过程
天冬氨酸 甲硫氨酸 苏氨酸
赖氨酸 天冬氨酸磷酸
天冬氨酸激酶
天冬氨酸β－半醛
抑制 高丝氨酸 高丝氨酸
脱氢酶(hom)
黄色短杆菌的代谢特点
天冬氨酸激酶（AK），是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制
协同反馈抑制：该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。
天冬氨酰磷酸
天冬氨酸-β-半醛
高丝氨酸 高丝氨酸磷酸
O-琥珀酸高丝氨酸
二氢吡啶-2,6-二羧酸
赖氨酸 苏氨酸 异亮氨酸
蛋氨酸 天冬氨酸 1 2
3 4 5 两个分支点的优先合成机制 ：
优先合成Hos，然后再优先合成Met
当Met过量时
阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶，使代谢流向合成Thr的方向进行
当Thr过量时
反馈抑制高丝氨酸脱氢酶，使代谢流向Lys的合成上。（Met＞Thr＞Lys）
育种途径 切断或减弱代谢支路
切断或减弱合成Met 、Thr的分支途径——选育营养缺陷型或渗漏突变株
A、需要选用HomL, 其意义在于：
优先合成的转换：可引起一种终产物的过量生成。
高比活性的HD使Thr优先合成。若往培养基里添加过量的Met，将HD的活性控制在原来活性的1/3，在野生株中也能积累5g/L lys，进一步通过突变将HD比活性降低到原来活性的1/3，可积累20g/L lys。
进一步通过突变将HD比活性降低到原来活性的1/3，可积累20g/L lys。在这样低的比活性下，不添加Thr和Met，野生菌株也能正常生长。但如果单独过量添加一种Thr或Met，反而由于过剩的Thr或Met抑制或阻遏本来已经活力很低的HD使Thr或Met合成不足而抑制生长。
结果：由于HD活性下降但不完全丧失，使代谢流发生变化，使原来优先合成Hos方向转向合成lys方向。而Thr和Met少量合成，生成的Thr的量不足以与lys共同对AK酶起协同反馈抑制，就使lys得以积累。
B、需要选用Hom-，其意义在于：
解除了Hom的优先合成机制，阻断了代谢向Met、Thr的方向进行，节省了原料，可以使Asp-β-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上。
在培养基中限量的供给Met 、Thr（或者Hom），对于AK酶活性的调节有着重要意义。因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶，限制了其中某一个抑制物（Thr），则Lys的浓度再高，也不会影响到AK酶的活性，那么，代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行，使得产物的合成畅通无阻。
双重营养缺陷型突变株（Met- + Thr-）,其本质和Hom- 相同。
优点：遗传性质稳定，回复突变的几率少。
人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸
天冬氨酸 中间产物Ⅰ
天冬氨酸激酶
中间产物Ⅱ 甲硫氨酸
苏氨酸 高丝氨酸 高丝氨酸
脱氢酶 不能合成 可以大量积累
赖氨酸 人工诱变的 菌种不能产生
解除反馈调节（—反馈阻抑）
从理论上讲，选育Hom- 进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hom- 是不够的。为了高效率的转化Lys，需要解决这一问题：
是该酶（AK）脱敏（就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力），如何使其脱敏呢？
选育结构类似物抗性突变株？（X r）
S-L-半胱氨酸抗性突变株 AEC r （效果最佳，应用最广）
γ-甲基赖氨酸抗性突变株 ML r
L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株 LysHxr
苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHxr
L- Lys:CH2(NH2) -CH2-CH2-CH2-CH (NH2)COOH
AEC: CH2(NH2) -CH2-S-CH2-CH (NH2)COOH
结构类似物AEC物的作用机制：起假反馈抑制作用
　　AEC 与L- Lys结构相似，被天冬氨酸激酶所误认，与Thr一起在天冬氨酸激酶的变构部位上结合，协同抑制酶活。
抗结构类似物突变株的实质：天冬氨酸激酶编码的结构基因发生突变。

其实节点法就是用来判断电路时并联还是串联的
1.在电源正极处标记a（大写小写都可以，汉字都行~），在电源负极处标记b。
2.任意移动a，让a顺着导线上任意移动（记住在导线上移动！别在纸上瞎动啊），但是记住当a遇到电阻（R1,R2,R3）时不能跨域电阻移动到电阻的另一端。这样在a停止的地方标记a（或者你认为重要的地方都标记a），记住一定要全面，a能走的地方一定要走！
3.确定a能走过的地方都走过以后，用同样的方法移动b。这样一来，你应该能看见R1,R2,R3的两端分别都有a和b。
4.接下来就是判断了：如果每个用电器两端都有a和b，那么这个电路就是并联的。

菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。

一、自然选育：从自然界分离获得菌种，根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种

一从自然界分离获得菌种

1. 采样：取地面5～15 cm的土壤。

2. 增殖培养：(富集培养enrichment) 提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。

方法：

（1）控制培养基的营养成分：如淀粉琼脂培养基用于丝状真菌增殖。

（2）控制培养条件：

细菌，放线菌：pH7.0～7.5 35～37℃

霉菌，酵母菌：pH 4.5～6.0 20～28℃

（3）抑制不需要的菌类

分离细菌：加入丙酸钠以抑制霉菌，酵母

分离厌氧菌：焦性没食子酸与氢氧化钠反应除氧

3. 纯种分离

（1）划线法：简单、快速。

（2）稀释法：在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的几率大，适合分离具有蔓延性的微生物。

固体培养基四区划法接种法

步骤一

接种针先以火焰灭菌法灭菌

步骤二

轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却

步骤三

以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。

步骤四

更换一个新的无菌营养平板

步骤五

将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区 。

步骤六

重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。

步骤七

由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。

步骤八

重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。

步骤九

重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。

步骤十

在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。

固体培养基的稀释涂抹接种法

【目的】用来分离单一菌落或用来估计样本中微生物的数目。

需要使用的仪器——震荡机

吸取准备好欲稀释的菌液

吸取充分均匀后的菌液

取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。

将试管于震荡机上，使菌液混合均匀

取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。

从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。

将三角玻璃棒浸于酒精中

将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）

使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。

4.生产性能的测定：纯种分离后得到菌株数量大，不可能一一进行性能测试。一般采用两步法：初筛，复筛。从而获得较好菌株（野生型菌株）（区别于变异菌株）。

初筛：以量为主

复筛：以质为主

二从自发突变体中获得菌株

微生物可遗传的特性发生变化称变异，又称突变，是微生物产生变种的根源，也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。但自发突变的频率较低，往往不能符合工业生产的要求。因此要利用诱变剂提高菌种的突变频率。
5.6 菌种筛选方法
所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴。

5.6.1菌种筛选方案 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。

5.6.2 菌种筛选的手段 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。

5.6.2.1 从菌体形态变异分析 有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。

5.6.2.2 平皿快速检测法 平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。 图 5.6.1 平皿快速检测法示意图 平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。

1) 纸片培养显色法 将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。

2) 变色圈法 将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。

3) 透明圈法 在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。 在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。

4) 生长圈法 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。 该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。

5) 抑制圈法 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。例如：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4-5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。

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临澧县15529213748： 何谓马铃薯的沟点种法? ？
裴盆迈甘： 在已春耕耙耱平整好的地上,先用犁开沟,沟 深10~15厘米,随后按株距要求将准备好的种薯点入沟中,种薯上 面再施种肥(腐熟好的有机肥料),然后开犁覆土.种完一行后,空 一犁再点种,即所谓“隔犁播种”,行距50厘米左右,依次类推,最 后再耙耱覆盖,或按行距要求用犁开沟点种均可.优点是省工省力, 简便易行,速度快,质量好,播种深度一致,适于大面积推广应用.

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临澧县15529213748： 点代法是什么 - ？
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临澧县15529213748： 生物中接种方法→平板划线法要注意什么 - ？
裴盆迈甘： (1)要注意全程无菌操作; (2)滑动时用力要均匀,切勿将接种环嵌入培养基内; (3)平板应较硬、较厚、表面干燥; (4)需要分区的时候,划完一个区后必须烧去接种环上的残菌,待冷却后再划另一个区; (5)划线的线条宜平行、密集...

临澧县15529213748： 什么是实地盘点法 - ？
裴盆迈甘： 概念: 实地盘点法就是运用度、量、衡等工具,通过点数,逐一确定被清查实物实有数的一种方法.这种方法适应范围较广,大多数财产物资都可采取这种方法.另外,这种方法数字准确可靠,但工作量较大. 优缺点: 优点是这种方法适应范围较广,大多数财产物资都可采取这种方法,并且这种方法数字准确可靠,但工作量较大. 局限性是实地盘点法的局限性是只适用于能直接查清数量的财产,对于应收账款等项目则不适用. 库存现金的清查主要是通过实地盘点法(就是点钞)进行清查.

临澧县15529213748： 等电势点法是怎么用的? - ？
裴盆迈甘： 首先就是这个电路有很明显的对称性,就是说比如从正极到负极的过程中,电流从两条路流到两个点,效果是一样的,就是说这两个点是等电势点,比如一个正方形电阻网,每边电阻相等,正负极在对角线上,那么另外的对角线上点就是等电势点,既然是等电势点,那么即使用导线连起来,导线中也没有电流流过,所以对电路没有影响,然而这个导线加上之后,就可以进行电阻的并联啊什么的,就可以把一个很复杂的电阻网络简化掉.

临澧县15529213748： 点差法和点和法是什么?在什么情况用?如何用? - ？
裴盆迈甘： 点差就是在求解圆锥曲线并且题目中交代直线与圆锥曲线相交被截的线段中点坐标的时候,利用直线和圆锥曲线的两个交点,并把交点代入圆锥曲线的方程,并作差.求出直线的斜率,然后利用中点求出直线方程. 利用点差法可以减少很多的计...

临澧县15529213748： 什么是五点法 - ？
裴盆迈甘： 五点取样法 点状取样法中常用的为五点取样法,当调查的总体为非长条形时,可用此法取样.在总体中按梅花形取5个样方,每个样方的长和宽要求一致.这种方法适用于调查植物个体分布比较均匀的情况. (1)取样调查中的两个概念 ①样 ...