单克隆抗体的鉴定实验

要获得一个基因的单克隆抗体，怎样设计实验方案~

下面是通过原核表达系统得到基因表达的产物以及制备多克隆抗体的一种方法：
1.得到目的基因：设计引物（引物上带有酶切位点）→进行PCR,胶回收,酶切,再胶回收,得到带有粘性末端的目的基因→将目的片段连接到具有相同粘性末端的PET载体上
2．得到目的蛋白：将连接好的带有目的片段的载体转入到DH5α菌系中,将菌涂布与相应的抗性LB培养过夜→挑菌→接到相应抗性的液态LB中,摇菌过夜→提取质粒,进行PCR鉴定与酶切鉴定确定转入的不是空质粒→送测→将的到地带有目的蛋白基因的质粒转入到BL21（DE3）菌系中→诱导表达蛋白→进行SDS-PAGE检测是否表达出正确大小目的蛋白→大量诱导→得到表达蛋白的DE3
3.纯化目的蛋白：将菌进行超声破碎→引用Ni-His结合树脂4℃结合过夜→应用不同洗液洗脱得到纯化的目的蛋白→应用BSA对蛋白含量进行定量
4.应用得到的纯化目的蛋白150mg目的蛋白+弗氏完全佐剂对兔子进行一免,以后每次应用150mg目的蛋白+弗氏不完全佐剂加强免疫2-3次（两周加强一次）→最后一次免疫10天后采血→这样就制备得到兔高免血清
5.纯化抗体（可做可不做）：应用抗体纯化试剂盒对得到的血清进行纯化,得到纯化的兔免目的蛋白的多克隆抗体

1. 将蛋白A-Sepharose置于Tris缓冲液中（超过50倍的量，v/v）充分溶胀。在室温下将其灌入直径为2.5 cm 玻璃层析柱中，用Tris缓冲液使其平衡。


2. 腹水浓稀释于3倍体积的Tris缓冲液，以1~5 ml/min 的速度上样于蛋白A-Sepharose柱，用Tris缓冲液洗柱子直至所有的未结合的蛋白都被洗脱，采用A280监测。

3. 依次用2~3倍柱床体积的柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液液以及甘氨酸·Cl缓冲液连续洗脱结合蛋白，洗脱下的蛋白直接接入装有中和缓冲液的管中，中和缓冲液的体积应为所收集蛋白体积的1/4。

4. 采用ELISA法检测抗原特异性MAb。

5. 在超滤器中浓缩所分离的单克隆抗体到1~5 mg/ml，所用超滤膜为XM50，将单克隆抗体存于-20℃。

1．杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。2．单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。
ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型的试剂盒说明书 1、首先将试剂盒恢复室温（大约30分），然后用纯水把清洗液配成工作浓度（一份浓缩清洗液加19份纯水）。
2、取出酶标板。每个标本需要6孔，阳性对照6孔。多余的用自封袋保存，记得放入干燥剂。
3、将细胞培养上清（或特异亲和纯化的抗体）50μl加入酶标微孔板，每个标本加6孔，阳性对照也是加6孔每孔50μl。然后每孔再加入50μl标本稀释液。贴上封板膜37℃温育30分钟。
4、弃去板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。再在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗各100μl，通用阳性对照的6孔也一样。在加样图上或酶标板上做好标记。贴上封板膜37℃温育30分钟。
5、吸弃板内液体，洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl，换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20分钟。
6、本试剂盒特异性好一般肉眼即可观察出结果，看显色蓝的那个孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。更可将反应终止液（每孔50μl）终止反应后用酶标仪450nm测定波长，630nm参考波长双波长测定结果，参看高值孔所对应的酶标二抗就知道此标本的Ig类或亚类。阳性对照0D小于0.5实验无效，需要重做。 1、虽然本试剂盒过期后很久还有使用价值但还是请您在有效期内使用。
2、在检测腹水类单抗时要稀释到1/5万，虽然可以分辨但并不建议您这样做。此类样品成分十分复杂，有干扰结果的可能。在此种情况下您可以选择本公司的C030215抗体鉴定试剂。它会给您带来满意的结果。
3、手洗板子时一定要把孔加满，停留10秒然后弃尽，最后要拍干净。特别是在酶标二抗温育后洗板时一定要把酶吸出而不是甩出，要吸净。这个在手工洗板时对结果很重要。
4、一次没用完的板子要带干燥剂放自封袋封好，随盒存放。
5、拿放板子时不要剧烈抖动，以免孔间交叉污染出现错误结果。
6、出现异常结果请随时咨询我们。
3．单抗的特异性鉴定可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。
4．单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。
5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。

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沈北新区17743033047： 单克隆抗体的鉴定实验 - ？
哀典德维： 1.杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行.2.单克隆抗体的类型、亚型的测定:购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清,采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型. ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型的试剂盒说明...

沈北新区17743033047： 如何鉴定单克隆抗体的性质? ？
哀典德维： 单克隆抗体分离纯化后需对其抗体性质作最后鉴定.目前已有许多鉴定方法,如夹心法的放射免疫测定、补体介导的溶血实验、ELISA、免疫酶染色以及玫瑰花结形成实验等.亦可用沉淀实验和凝集实验.现以ELISA方法最为常用.根据抗体产生,应制备、纯化已知的可溶性抗原或颗粒性抗原,用于检测单克隆抗体,一般先作定性测定,如阳性进一步做定量检测.常用的检测程序是在纯化前对上清液单克隆抗体定性和定量检测,若阳性并且效价较高,纯化后再进一步定量检测,确定其工作浓度.

沈北新区17743033047： 单克隆抗体细胞的选择的实验步骤. - ？
哀典德维： 1. 材料1) 小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只.2) 11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌).2. 操作方法1) 拉颈处死小鼠.2) 70%酒精浸泡消毒10min.3) 用手copy术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.4) 用注射器将4ml ...

沈北新区17743033047： 单克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些 - ？
哀典德维： 答案A 点拨:单克隆抗体是蛋白质,不是细胞,所以①不正确;其制备过程中至少有两次筛选,一次是筛选出杂交瘤细胞,第二次是筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞,所以②正确;由于是单个杂交瘤细胞无性繁殖产生的高度单一的抗体,所以叫单克隆抗体...

沈北新区17743033047： ELISA技术测定单克隆抗体效价方法有吗?？
哀典德维： 一、实验目的 1.深入了解ELISA 法测定抗体效价的原理. 2.掌握ELISA 法测定单克隆抗体效价的方法. 二、实验原理 ELISA 是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技...

沈北新区17743033047： 单克隆抗体实验如图所示. 请回答下列问题: (1)小白鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞能融合在一起 体现了细胞膜具有________的特点. (2) 制备单克隆抗体... - ？
哀典德维：[答案] (1)一定的流动性(2)动物细胞融合、动物细胞培养 杂交瘤 体液(3)抗体是蛋白质,若口服则被消化,使抗体失去其功能(4)有丝加倍龙胆紫(5)无限增殖 产生单一抗体

沈北新区17743033047： 高中生物一单克隆抗体实验问题. - ？
哀典德维： 单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的,杂交瘤细胞由骨髓瘤细胞和效应B细胞融合而成.只有效应B细胞(浆细胞)能产生抗体,而未经免疫的B淋巴细胞不能产生抗体

沈北新区17743033047： 本人想做一种鉴定细菌的单克隆抗体,求助 - ？
哀典德维： 1、免疫:将培养好的细菌用PBS或生理盐水充分洗涤几次后,用麦氏比浊管进行比浊计数,计数后就可以进行免疫了.2、检测:用你做的细菌的特异性抗原决定簇所在的抗原(膜抗原、鞭毛抗原等)进行包被酶标板.3、特异性鉴定:用与你做的细菌具有相似结够的细菌做交叉反应.其他的步骤跟常规做单抗的步骤一致.本数据来源于百度地图,最终结果以百度地图最新数据为准.

沈北新区17743033047： 单克隆抗体制备的基本原理与过程?有什么意义? - ？
哀典德维： 哈哈~我们刚考到这题 原理: B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力.B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的.将这种B细胞与...

沈北新区17743033047： 求解:玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及鉴定？
哀典德维： 目的研究制备抗玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)单克隆抗体免疫亲和柱(IAC).方法用辛酸硫酸铵法纯化抗ZEN单克隆抗体,将纯化好的单抗与溴化氰活化的4FF葡聚糖偶联制备抗ZEN单克隆抗体免疫亲合柱.采用紫外扫描鉴定偶联反应,...