如何分析流式细胞术测定活性氧结果
ROS的流式检测
活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。
一、注意事项
1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
二、使用说明
1、装载探针
对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激
时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
2.、检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
4、其它说明
阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
这种四个象限的图，一般都是看两种染色的关系（横坐标和纵坐标）。
左下象限，是两种目标抗原都没有表达（染色阴性）。右上象限，是两种都有表达（双阳性）。
而左上象限则是纵坐标的那个抗原有表达（单阳性），但是横坐标那个没有表达（阴性）
右下象限是横坐标那个抗原有表达（单阳性），但纵坐标那个没有表达
这个图没有贴出来的是做实验时候的阴性对照（全部在左下象限），这样才能原来设置象限的位置。还有做代偿的对照（compensation control），是设置机器，排除假阳性用的。
一、注意事项
1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
二、使用说明
1、装载探针
对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激
时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
2.、检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
4、其它说明
阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
流式细胞术:原理、操作及应用基本信息
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流式细胞术的简介
1.1流式细胞术简介 流式细胞术（FCM）是一种利用流式细胞仪来检测单个微粒特性或对特定群体进行分选的技术，以其快速、准确和客观性著称。它涉及样品的液流技术、细胞计数和分选技术，以及数据的采集和分析技术。流式细胞仪是将流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机技术综合...
请教流式细胞术PI染色进行细胞周期分析的原理
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如何看流式细胞术结果中的图
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流式细胞仪分析技术及应用
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干货分享 | 一文读懂流式细胞术
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流式细胞术:原理、操作及应用目录
流式细胞术：原理、操作及应用目录 序 前言 2 流式细胞仪的原理 流式细胞仪基于液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统，实现了对细胞进行实时、高精度分析。液流系统负责将样品以单细胞为单位通过管道流动；光路系统利用激光光源对样品进行激发，同时通过检测器收集细胞散射和荧光信号；检测分析系统对...
流式细胞术的原理和应用
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流式细胞仪进行淋巴细胞及其亚群分析时,主要利用的技术是( )。_百度...
【答案】：C 流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。被测细胞经荧光染色后受合适的激发光刺激产生...
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利津县13730439649： 影响流式细胞术实验结果的主要因数有哪些 - ？
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利津县13730439649： 流式细胞仪活性氧试剂盒阴性对照荧光强度大概多少 - ？
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利津县13730439649： 流式细胞术图像如何分析 - ？
仪保艾略： 那些方框叫做圈门,旁边的数字说的是门里面所占的百分比,后面那2张图是计数,右上计数的是48%那群的,下图是计数45%那个门里面的, 整张图的横坐标左边是阴性,右边是阳性
利津县13730439649： 请教,流式细胞术结果应该用设门法还是平均荧光强度统计 - ？
仪保艾略： 这个要看你具体的实验.一般的原则是先gate出所需要的细胞群,然后再看染色.流式检测大多数情况都是检测相对的百分比,而不是平均荧光强度.同一种荧光通道,都是阳性细胞,可以比较荧光强度
利津县13730439649： 流式细胞术怎么检测 autofluorescence - ？
仪保艾略： 所谓autofluorescence就是细胞在没有使用荧光抗体或者荧光染料染色时所发出的荧光.细胞内的很多大分子都可以被激发而发出荧光.因为流式细胞仪是检测的相对荧光强度,所以必须要有对照才能进行比较. 一般把未染色的细胞作为阴性对照,其发出的本地荧光作为阴性的阈值,高于该阈值的,认为是染色所导致的阳性信号.
利津县13730439649： 组织中的ros一般用什么方法检测 - ？
仪保艾略： 活性氧检测试剂盒是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的.DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH.而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内.细胞内的活...
利津县13730439649： 流式细胞仪的原理和操作过程 - ？
仪保艾略： 原理: 流式细胞仪可同时进行多参数测量,信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号.测量是在测量区进行的,所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点.液流中央的单个细胞通过测量区时,受到激光照射会向立体角...
利津县13730439649： 什么是流式细胞术 - ？
仪保艾略： 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术.
利津县13730439649： 流式细胞仪测定细胞活性氧中阴性细胞(未加探针的)为什么有荧光?谢谢. - ？
仪保艾略： 大部分细胞是有本底荧光的,所以在加探针前要把阴性细胞的荧光值设为阴性.也就是认为的设一个阈值而已.
