用氯化钙制备感受态细胞的做转化后一个菌落都张不出的原因 我是按照文献步骤做的呀
你直接拿没有切的质粒去转化涂板 看有没有长 如果长了就是连接的问题 如果没长就是感受态的问题
1.你到底是 感受态没制备好呢？还是转化了，但平板上没克隆呢？
2.你转一个有人转成功过的试试，排除感受态和你自己操作是不是有问题？
3.你用的是 哪种菌啊？LBA4404？GV3101? 3抗有没有+错啊？
4.你是电击？热击？
1、感受态不好。“待细菌达到对数生长期（OD600为0.5-0.6）”，你测OD了吗？其实很麻烦，建议稍微有点混就好用了；感受态细菌在无抗生素培养基上能否生长？
2、菌株与质粒不兼容。
3、转化体系也很关键。DNA宁可少点，多了影响效率。
4、DNA是否正确，至少是环状的。有无做超螺旋质粒的阳性对照？如果你做的是质粒构建的话，转化效率很低，有个对照会很好判断意外。
5、转化过程的操作。热休克、和复苏是否正确？复苏时不能加抗生素？
6、培养基是否正确？
建议做阳性对照（质粒）和阴性对照（没转化的感受态不能生长），有了对照结果就好判断了
你转化是怎么做的？会不会是转化没做好，质粒用的是什么质粒，标准品吗？会不会是质粒不好用，或者是抗性搞错了。
氯化钙制备感受态细胞的原理
用氯化钙溶液制取感受态细胞的原理是：氯化钙溶液可使得细胞膨胀，细胞膜磷脂双分支层形成液晶结构，使细胞的通透性变大，便于外源基因或载体进入感受态细胞。具体原理如下：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时钙离子会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构...
制备感受态细胞最常用的盐是
制备感受态细胞时，磷酸钙常常与氯化钙同时使用，形成磷酸钙-DNA-氯化钙复合物，进一步增强细胞的转化能力。3、硝酸钙在制备感受态细胞中具有促进DNA聚集和增加细胞膜通透性的作用。硝酸根离子能够与DNA中的磷酸基团相互作用，促进DNA的聚集，使细胞内的DNA形成一种易于接受外源DNA的状态。同时，硝酸钙还可以增...
氯化钙制备感受态细胞的原理
诱导细胞产生感受态。利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，进而引发细胞内钙离子浓度升高，从而诱导细胞产生感受态是氯化钙制备感受态细胞的原理。
氯化钙制备感受态细胞的方法常用在细菌上,能不能用在酵母菌上啊?如果不...
氯化钙只能制作细菌感受态，酵母菌要用冷的山梨醇洗 。平板筛选毕赤酵母GS115单菌落后，制备1 mL菌液接种于100 mL YPD液体培养基中，30 ℃200 rpm培养约15 h，使菌浓度达到OD600 1.2~1.5左右后，冰浴降温。4℃、5000 rpm离心5 min，弃上清，使用100 mL冰ddH2O重悬。4℃、5000 rpm离心10 min...
以氯化钙法制备的感受态细胞转化DNA时,冰浴15分钟的主要目的是什么...
【答案】：冰浴的目的：①抑制细胞的生理代谢；②有助于DNA形成羟基钙磷酸复合物吸附于细胞表面；③防止。DNase降解DNA。热休克温度是42℃；目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA。
感受态的制备
结论：氯化钙法是一种有效的大规模制备大肠杆菌感受态细胞的方法，能获得大量转化克隆。以下是制备步骤的详细改写：首先，从37°C过夜培养的单菌落中挑取直径约2-3毫米的菌落，接种到5毫升LB肉汤的30毫升试管中，培养过夜。然后，将0.2毫升培养物转移至装有LB的50毫升三角瓶，继续在37°C下振荡培养2-...
感受态的制备
氯化钙法（Calcium Chloride）本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得5 x 106 到 2x 107 转化克隆\/微克超螺旋质粒DNA 材料（MATERIALS）缓冲液和溶液（Buffers and Solutions）（冰冷的）CaCl2•2H2O (1 M)冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold)培养基（Media）用...
为什么用氯化钙制备感受态细胞?
钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。
用氯化钙制备感受态细胞的做转化后一个菌落都张不出的原因 我是按照文...
1、感受态不好。“待细菌达到对数生长期（OD600为0.5-0.6）”，你测OD了吗？其实很麻烦，建议稍微有点混就好用了；感受态细菌在无抗生素培养基上能否生长？2、菌株与质粒不兼容。3、转化体系也很关键。DNA宁可少点，多了影响效率。4、DNA是否正确，至少是环状的。有无做超螺旋质粒的阳性对照？如果...
制备感受态细胞时为什么氯化钙要冷冻
不知道您到底想知道什么？制备感受态细胞当然要冷冻啦，冷热交替使得细胞壁很脆弱，这样外源DNA导入才更加容易。在制备转基因时，导入外源DNA方法有很多的，不过目前比较简单和普遍的做法就是用氯化钙处理的。谢谢！
芮岭银杏： 这属于专业问题啦 下面的简单方案是Clhen等(1972)所用方法的变通方案,常用于成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克螺旋质粒DNA产生5x106-2x107 个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要.该方法...
驿城区17533999010： CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理? - ？
芮岭银杏： 原理:转化:将外源DNA分子引入受体细菌,使之获得新的遗传性状. 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株,不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-),可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代.受体细胞经过一些特...
驿城区17533999010： CaCl2制备感受态细胞转化DNA时,低温的目的是什么?热休克的温度及目的是什么 - ？
芮岭银杏： 冰浴过程中,原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合,在低温下形成液晶结构,这样,在42度热激下,这种液晶结构收缩,将细胞膜扯开孔道,使DNA进入细菌细胞中.这就是原理.
驿城区17533999010： 感受态细胞的制备和转化中 为什么要加两次Cacl2?Cacl2为什么要预冷 - ？
芮岭银杏： 方法一: 细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化. 用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌.
驿城区17533999010： 制备感受态细胞的关键是什么 - ？
芮岭银杏： 制备感受态细胞的关键是将外源DNA分子引入受体细菌,使之获得新的遗传性状. 主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞.由于细胞膜的流动性,这种孔洞...
驿城区17533999010： 制备感受态的时候,先前的CaCl2重悬细菌,然后再离心,最后在用100 - 200μlCaCl2重悬细菌,即可用于转化,那么先后两步用CaCl2的目的是否一样?不一... - ？
芮岭银杏：[答案] 目的一样,但两次可以充分达到制备感受态细胞的效果,造成一个低渗的环境.有条件当然需要超净工作台,但一个酒精灯也够了. 注意事项嘛:保持低温;据分子克隆介绍,做好的感受态细胞在4度冰箱过夜可提高转化效率;分装保存在低温冰箱,...
驿城区17533999010： 用氯化钙法将质粒DNA转入大肠杆菌实验中,转化成功的关键有哪些? - ？
芮岭银杏： 影响转化效率的因素很多,主要有:感受态细胞制备的质量、受体菌生长期(大肠杆菌在对数生长期易产生感受态)、质粒的大小和构型、所用试剂的纯度、接种前菌种的保藏方式、冰浴时间(延长冰浴时间可略微提高转化率)、器皿的清洁度...
驿城区17533999010： 在做转化时,外源DNA与感受态细胞混匀后为什么要冰上放置30分钟后热激? - ？
芮岭银杏：[答案] 这是用热激法进行的转化.以大肠杆菌为例,大肠杆菌在0摄氏度的氯化钙低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42摄氏度短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰...
驿城区17533999010： 将目的基因导入微生物细胞时,用钙离子处理细胞,有什么作用,它处理的是什么 - ？
芮岭银杏： 钙离子处理过的细胞称为感受态细胞 .所谓感受态 就是能够比较容易吸收物质 即通透性变大 不管是原核还是真核的都可以.用氯化钙处理细菌后,实质是增加了细胞膜的通透性,不是细胞壁. 细胞壁本来就是全透性的 .
驿城区17533999010： cacl2法制感受态细胞:最近用此法制备感受态细胞,但是转化后的效率很低,几天看看平白机会一个没有长.？
芮岭银杏： 首先要掌握好培养时间,细胞对数生长期的时候再做,一般OD600为0.5左右.其次,在制备的时候要注意一定要整个过程都在冰上,保持低温很重要,特别是离心过程,冷冻离心机要先预冷后再用. 实在不行试试冰浴水洗法吧,操作简单而且电击转化效率很高的.
