微生物平板菌落计数法具体实验步骤

微生物检验中饮料的大肠菌群平板计数法具体操作步骤是怎样的？~

两个平板总共挑选10个典型菌落或者是可疑菌落（是五五分还是四六分这个全凭你心情了），有的菌落长的在10个以下的就有几个接种几管就OK了。
每次接种前将典型和可疑菌落分类，哪个多就多接种几管，少的就少接种几管，每个样品只需选15-150菌落间的稀释度接种BGLB管。
接种的目的是看是否产气且是否有大肠。

微生物的显微直接计数法

一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
五、实验作业：
将实验结果填入下表中：
计数次数 每个大方格菌数 稀 释
倍 数 试管斜面中的总菌数 平均值
1 2 3 4 5
第一次
第二次

一、目的要求

学习平板菌落计数的基本原理和方法。

二、基本原理

平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时,先将待测样品作一系列稀释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含菌数。

这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定(如杀虫菌剂),生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁,而且测定值常受各种因素的影响。

三、器材

大肠杆菌悬液,牛肉膏蛋白胨培养基, 1ml无菌吸管,无菌平皿,盛有4． 5 ml无菌水的试管,试管架和记号笔等。

四、操作步骤

1．编号：

取无菌平皿 9套,分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml无菌水的试管,排列于试管架上,依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀释

用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中,注意吸管尖端不要碰到液面,以免吹出时,管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次,吸时伸入管底,吹时离开水面,使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0．5ml放入10-2试管中,吸吹三次,……其余依次类推。整个稀释过程如图Ⅷ-3。

3．取样

用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml,对号放入编好号的无菌培养皿中。

4．倒平板

于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中,倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml,置水平位置,迅速旋动混匀,待凝固后,倒置于37℃温室中培养。

5．计数

培养24小时后,取出培养皿,算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数,并按下列公式进行计算：

每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊,如相差较大,表示试验不精确。

平板菌落计数法,所选择倒平板的稀释度是很重要的,一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

平板菌蓓计数法的操作除上述的以外,还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同,所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板,待凝固后编号,并于 37℃温室中烘烤30分钟左右,使其干燥,然后用无菌吸管吸取 0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上,再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于实验台上20—30分钟,使菌液渗透入培养基内,然后再倒置于37℃的温室中培养。

五、实验报告

1．结果

将计数结果填入下表。

2．思考题

(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？

(2)要使平板菌落计数准确,需要掌握哪几个关键？为什么？

(3)同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数,所得结果是否一样？为什么？

(4)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。

做做实验就楼上那样，要标准的话去参考国家标准。

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大荔县13229746090： 怎样用平板菌落计数法测定微生物活菌数? - ？
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大荔县13229746090： 平板菌落计数法下分几种类型,每种类型的操作步骤分别是什么,优缺点分别是什么? - ？
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